细胞异质性能够揭示同一个体中不同部分的情况,而常规生物学分析手段往往是将大量细胞混合在一起,最后得到的检测结果是大量细胞的平均结果,掩盖了细胞的异质性。同一组织中,不同细胞承担了不同的生理功能;同一个细胞在不同时期也会表现出不同的状态。因此能够获得带有空间、时间等信息的单细胞分析技术对推动生命科学的研究具有积极意义[77]。根据研究对象不同,单细胞组学分析包括单细胞基因组分析[78]、单细胞转录组分析[79]、单细胞蛋白质组分析[80]、单细胞代谢组分析[81]以及表观基因组分析[82]等。就单细胞蛋白质组而言,目前质谱仪器的灵敏度足以用于分析单细胞内低丰度的蛋白质,部分仪器的检出限达到10-18mol[83],结合HPLC的分离能力,基于HPLC-MS的方法具有分析单个细胞整个蛋白质组的潜力。

单细胞蛋白质组分析的难点主要是样品中的蛋白质含量太少,哺乳动物体细胞内的蛋白质含量仅为0.1 ng[84],而使用鸟枪法进行蛋白质组学分析时,细胞需要经过一系列复杂的处理才能够进入质谱分析。目标物在样品处理过程中以及后续色谱分析时极易被吸附,造成严重损失。同时,因样品量太少,实验过程对检测系统的灵敏度要求极高。因此需要建立合适的样品处理方法,尽量减少损失。

传统大体积蛋白质组样品的处理方式并不适用于少量细胞的研究。研究者们对于少量细胞的样品处理方式进行了尝试[85,⇓⇓⇓-89]。对于需要进入质谱分析的单细胞样品,它的处理过程要求更为苛刻。大部分方法在操作时使用含有表面活性剂和其他化学物质的缓冲溶液来制备样品。而这些试剂往往和质谱不兼容,需要使用超滤或者置换等方式来进行除盐除杂。因此不可避免会造成样品损失,而这样的损失对于单细胞分析来说可能是致命的。因此,单细胞蛋白质组分析中,样品处理非常关键。开发出一个不引入质谱不兼容物质且能够尽量减小样品接触面积的方法,对于提高最后鉴定到的蛋白质数量具有非常重要的意义。

Shi课题组[90]提出了简便的表面活性剂辅助的一锅样品前处理-质谱法(SOPs-MS),并对50~1000个MCF10A细胞中的1200~2700个蛋白质进行定量,样品处理体积为50 μL,能够兼容目前使用的商业化实验器械。但是对于单细胞样品来说,μL级体积的接触面积仍然很大,减小样品制备的体积可以减小样品与外界接触的表面积,从而减小吸附损失。因此也有研究者将关注点放在减小样品的处理体积上。

本课题组[91]在2015年开发的iPAD-100(an integrated proteome analysis device for 100 cells)系统通过一次性将细胞与裂解试剂、酶的混合液共同吸入毛细管中,然后在系统中进行消化、富集,直接分离分析,实现了对于100个杜克氏C型结直肠腺癌(DLD-1)细胞的分析。在细胞被引入系统后,程序能自动运行,避免复杂的样品处理步骤,减少样品损失,防止样品污染,提高灵敏度。100个细胞处理的体积为3.2 μL,最后在100个DLD细胞中鉴定到651种蛋白质。之后,我们在iPAD-100的基础上进行改进,于2018年提出了iPAD-1(an integrated proteome analysis device for 1 cells)方法[92]。直接将2 nL含有单个细胞、裂解试剂和酶的混合液吸入22 μm的毛细管中进行超声、加热处理,并使用22 μm内径的短毛细管柱分析,一个样品的分析时间为1 h,最后在1个HeLa细胞内成功鉴定到181种蛋白质。

Fang课题组[93]在2013年提出了一种用于pL级液体加样的全自动系统(SODA)。系统使用锥形毛细管作为操作管,使用注射泵来控制注射针连接毛细管液面移动。液滴的操作在一个玻璃基底的微芯片上进行,表面有2 mm厚的油层防止液体蒸发。通过编写好的程序,毛细管逐步进行液体的吸取和滴加,油层的密封使得pL级的液滴基本没有蒸发损失。2018年,Zhu等[94]报道了一套NanoPOTS(nanodroplet processing in one pot for trace samples)系统,实现了对10~100个哺乳动物细胞的蛋白质组分析,成功在10个细胞中检测到1500种蛋白质。NanoPOTS将玻璃芯片作为液体操作的平台,使用盖子减少反应过程中的液体蒸发。为减小接触面积,芯片上的样品点为亲水表面,而周围进行疏水处理,样品因为表面张力的作用可以只与凸起的表面接触,减小接触面积,最后处理的液滴体积为200 nL。2020年,该课题组[95]实现了nanoPOTs系统与LC-MS的连接,能够自动化地进行上样和分析。通过在系统中加入十通阀进行切换,实现冻干的酶解液复溶及液相色谱-质谱检测。此系统,在每天处理24个细胞的情况下,平均鉴定到256种蛋白质。