申请/专利权人：山东大学

申请日：2019-09-10

公开（公告）日：2022-10-28

公开（公告）号：CN110590888B

主分类号：C07H19/213

分类号：C07H19/213;C07H1/06;C07H21/02;B01D15/38

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.10.28#授权;2020.01.14#实质审查的生效;2019.12.20#公开

摘要：本发明公开了一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法，属于微生物发酵提纯的技术领域。本发明是利用了镍螯合琼脂糖为固相载体，与C端带有组氨酸标签His‑tag的人源干扰素基因刺激蛋白的配体结合结构域STINGLBD,residues149‑341相结合后，填入柱子中制成STING亲合柱。该亲合柱能够和环二核苷酸特异性结合，然后可通过含尿素溶液对所结合的配体进行专一的洗脱。本发明的有益效果为：1、解决了现有技术无法从复杂样品中直接提取环二核苷酸的难题；2、只需经过一步纯化即可从复杂样品中获得纯度＞80％的环二核苷酸；3、大大的降低了环二核苷酸的制备成本。

主权项：1.一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法，其特征在于，所述方法是利用STING亲和柱从复杂样品中分离环二核苷酸，所述STING亲和柱的固相载体是快流速型镍螯合琼脂糖；具体的操作步骤如下：（1）将人源干扰素基因刺激蛋白STING149-341位的配体结构域STINGLBD所对应的基因通过PCR扩增并构建到pet30a载体上，所用酶切位点是NdeI和XhoI，产生一个C端Histag；（2）将重组质粒pet30a-STINGLBD转入E.coliBL21DE3中，并转移到含有50ugml卡那抗生素的固体LB培养板上，然后置于37℃过夜培养，出现菌落；（3）挑单克隆接种到含有50ugml卡那抗生素的液体LB，37℃振荡培养过夜；取过夜培养菌1:100接种到含有50ugml卡那抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600到0.7~0.8，加入终浓度为0.1mmolL的IPTG，18℃诱导16h；（4）收菌，低温4℃离心，离心参数：转速3500rpm，时间30min；（5）快流速型镍螯合琼脂糖预处理，取50ml未加载的快流速型金属离子螯合琼脂糖装在长25cm，内径为2.2cm玻璃柱子里，先用300ml双蒸水冲洗，后用200ml50mmolLEDTA冲洗柱子，接着用双蒸水冲洗，再用1mmolLNaOH浸泡半小时；接着用双蒸水冲洗柱子至中性，加入0.1mmolLNiSO4，使Ni2+离子结合到基质上，再用双蒸水冲洗掉多余的Ni2+离子，制成镍螯合琼脂糖柱子；其中，未加载的快流速型金属离子螯合琼脂糖为IMAC琼脂糖，产品型号为cat.no.17057502，生产厂家为GEHealthcare；（6）制备STING亲合柱；用重悬缓冲液平衡镍螯合琼脂糖柱子后，将步骤（4）所得上清样品，加入螯合琼脂糖柱子，使STINGLBD蛋白被镍螯合琼脂糖结合，然后用漂洗缓冲液冲洗柱子，再用1L重悬缓冲液冲洗柱子，接着用500ml2mmolL尿素冲洗柱子，最后再用500ml的重悬缓冲液冲洗柱子并存放在重悬缓冲液中，存放于4-10℃中待用；其中，漂洗缓冲液为20mmolLTris-HCl，pH=8.0，200mmolLNaCl水溶液，20mmoL咪唑水溶液；重悬缓冲液为20mmolLTris-HCl，pH=8.0，200mmolLNaCl水溶液；或，使用nhs活化琼脂糖凝胶或cnbr活化琼脂糖凝胶代替快流速型镍螯合琼脂糖作为STING亲和柱的固相载体；（7）取通过微生物发酵法所得的含有高浓度环二核苷酸的大肠杆菌菌体，加入重悬缓冲液重悬菌体，高压破碎后，低温4℃离心，离心参数：12000g，60min；（8）取上清液，沸水浴15min，待冷却后，再次低温4℃离心，离心参数：12000g，60min；取上清液，用0.22~0.45μm的滤膜过滤，然后加入2倍体积的重悬缓冲液稀释样品，将样品加入已平衡好的STING亲合柱，流穿样品也被收集保留；上样结束后，用300mmolL的醋酸钠冲洗柱子，流穿样品也被收集保留；待冲洗结束后，用0.1~1.5mmolL尿素溶液洗脱环二核苷酸，直至核酸浓度小于5ngul，时停止收集洗脱液，核酸浓度用K5600微量分光光度计检测；将前面所得流穿样品合并加入STING亲合柱，再次进行冲洗和洗脱纯化环二核苷酸；样品的产率达90%，HPLC液相紫外图谱显示已没有明显的杂峰，纯度80%；（9）洗脱结束后，用2molL尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液大量冲洗平衡柱子，存放于4~10℃中待下次使用。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东大学 一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法

免责声明 1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。 2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。