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摘要：

己糖激酶(HXK)在高等植物糖酵解,糖信号转导和激素信号转导过程中都发挥着重要的功能.拟南芥HXK1的功能研究发现HXK1G104D和HXK1S177A两个突变体虽然失去己糖激酶的催化功能,但是依然保持正常的糖信号转导功能,表明拟南芥HXK1蛋白(AtHXK1)参与糖酵解通路和糖信号转导途径是两个独立的过程.进一步的研究发现AtHXK1能够在细胞核内与VHAB1和RPT5B形成蛋白复合体,通过调控CAB(叶绿素a/b结合蛋白)基因的表达,影响光合作用,从而行使糖信号的功能. 目前,哺乳动物和酵母中的HXKs蛋白结构都已得到解析,但关于植物中HXKs蛋白的结构尚未见报道.因此开展拟南芥AtHXK1的结构研究,对于解释其在植物体内糖酵解和和糖信号双功能的分子机制是十分必要的. 本文对拟南芥AtHXK1的部分生化特性进行了研究,并对其三维结构进行了解析.首先,我们通过葡萄糖结合实验,发现AtHXK1G104D和AtHXK1S177A对葡萄糖的亲和性比野生型AtHXK1高4-6倍.利用X射线衍射的方法,我们解析了AtHXK1三种状态(未结合葡萄糖的apo-AtHXK1,结合葡萄糖的glc-AtHXK1及结合葡萄糖的突变体glc-AtHXK1S177A)的晶体结构,其分辨率分别为1.8(A),2.1(A),2.0(A).我们进一步比较了结合(glc-)和未结合(apo-)底物的AtHXK1结构发现,与其他物种的HXKs蛋白类似,AtHXK1也存在底物"诱导契合"机制.另外,对比分析了结合葡萄糖的AtHXK1与AtHXK1S177A的结构发现结合葡萄糖后的两者折叠模式基本相似,底物结合位点也没有明显区别.通过对AtHXK1S177A晶体结构的研究,我们提出了AtHXK1执行糖信号的功能时的构象即AtHXK1(AtHXK1S177A)蛋白结合葡萄糖时的构象的假设.ATP结合实验表明,AtHXK1对葡萄糖和ATP的结合机制存在一个"先结合葡萄糖再结合ATP"的有序结合机制.基于该机制,在结合葡萄糖AtHXK1(glc-AtHXK1)的结构基础上建立了ATP分子对接模型,通过分析此分子对接模型中ATP和葡萄糖的结合位点,找到了参与催化功能的关键氨基酸位点(Asp230,Gly104,Ser177),并分别阐明了它们在催化过程中的作用.综上所述,我们提出了AtHXK1在植物体内的工作模式是以结合葡萄糖(glc-AtHXK1)的构象为中心. 此外,本论文试图通过体外酵母双杂交和pull-down实验研究AtHXK1与VHAB1和RPT5B全长(或截短体)的相互作用,并在体外得到AtHXK1与VHAB1和RPT5B互作的蛋白复合体.可能由于VHAB1和RPT5B在体外表达系统中不能正确折叠或者体外互作较弱等原因,本文未能在体外条件下得到AtHXK1与VHAB1和RPT5B的互作蛋白复合物.

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关键词：

己糖激酶 糖感受器 葡萄糖 拟南芥 基因表达

年份：

2016