实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS |
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实验十
聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE )分离蛋白质
【实验目的】
1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理;
2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】
在生物化学、分子生物学和基因(遗传)工程实验中,常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯 酰胺凝胶电泳( Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE )是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白 质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体( acrylamide ,简称 ACR )和交联 剂 N , N- 甲叉双丙烯酰胺( N,N-methylene bisacrylsmide 简称 BIS )在催化剂的作用下聚合交联而成的 三维网状结构的凝胶。 通过改变单体浓度与交联剂的比例, 可以得到不同孔径的凝胶, 用于分离分子 量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种: ( 1 )化学聚合:催化剂采用过硫酸铵, 加速剂为 N,N,N,N -四甲基乙二胺(简称 TEMED ) 。通常控制这二种溶液的用量,使聚合在 1 小时内 完成。 ( 2 ) 光聚合: 通常用核黄素为催化剂, 通过控制光照时间、 强度控制聚合时间, 也可加入 TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类:第一类为连续的凝胶(仅有分离胶)电泳;第二类为不连续的凝胶 (浓缩胶和分离胶)电泳。
一般地,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应:①电荷效应(电泳物所带电荷的差异性) ;
②凝 胶的分子筛效应(凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致) 。③浓缩效应(浓缩胶与分离胶中 聚丙烯酰胺的浓度及 pH 的不同,即不连续性所致) 。因此,样品分离效果好,分辨率高。
SDS 即十二烷基硫酸钠( Sodium Dodecyl Sulfate ,简称 SDS )是阴离子表面活性剂,它能以一定比例 和蛋白质结合,形成一种 SDS- 蛋白质复合物。 这时,蛋白质即带有大量的负电荷,并远远超过了其原 来的电荷, 从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。 与此同时, 蛋白质在 SDS 作用下结构 变得松散, 形状趋于一致, 所以各种 SDS- 蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异, 仅仅取决 于蛋白质的分子量。另外, SDS- 蛋白质复合物在强还原剂
(巯基乙醇)存在下,蛋白质分子内二硫 键被打开,这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时,蛋白质的迁移率 和分子量的对数呈线性关系,符合下式: logMW=K-bX ,式中: MW 为分子量, X 为迁移率, k 、 b 均 为常数。
本实验采用化学聚合法制胶, 进行不连续的凝胶电泳, 并用考马斯亮蓝快速染色, 以分离和鉴定大肠 杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。
【试剂与器材】
(一)试剂( ( 全班分两大组,每组配一份,如 1 - 5 组一份, 6 - 10 组一份 ) ( 1 ) 30% 的凝胶贮备液: ACR 30g + Bis
0.8g 溶于
100 mL 去离子水中,用 3 号新华滤纸过滤至棕 色瓶中, 4 ℃
避光贮存( 1 ) 。
( 2 ) 3mol/L Tris-buffer,pH8.9 :
Tris base 36.6 g + 1 mol/L
HCl 48 mL + ddH₂O 至 100 mL )
( 3 ) 0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 :
6.05g Tris base 溶于 40mL ddH₂O 中,加 1mol/L HCl 48mL, 加水补至 100mL. ( 4 ) 5 × Tris- 甘氨酸电泳 buffer ( pH8.3): (配 1L )
Tris-base 15.1g + 甘氨酸 94g + 5g SDS + H2O 至 1L (用时稀释 5 倍) 。
( 5 ) 10% SDS: :称 10 克 SDS 溶解于 100mL 去离子水中,贮存于室温中。
( 6 ) TEMED (四甲基乙二胺) :浓度 10% , 20 mL ( 全班共用 ) , 4 ℃保存。
( 7 ) 10% AP (过硫酸铵) : 10 mL ,新鲜配制,分装至 1.5mL 离心管中,- 20 ℃保
存待用( 2 ) 。
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