实验十

聚丙烯酰胺凝胶电泳（

SDS-PAGE

）分离蛋白质

【实验目的】

1. 

了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；

2. 

掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。

【实验原理】

在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯

酰胺凝胶电泳（

Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE

）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白

质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（

acrylamide

，简称

ACR

）和交联

剂

N

，

N-

甲叉双丙烯酰胺（

N,N-methylene bisacrylsmide 

简称

BIS

）在催化剂的作用下聚合交联而成的

三维网状结构的凝胶。

通过改变单体浓度与交联剂的比例，

可以得到不同孔径的凝胶，

用于分离分子

量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：

（

1

）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，

加速剂为

N,N,N,N

－四甲基乙二胺（简称

TEMED

）

。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在

1

小时内

完成。

（

2

）

光聚合：

通常用核黄素为催化剂，

通过控制光照时间、

强度控制聚合时间，

也可加入

TEMED

加速反应。

聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶

（浓缩胶和分离胶）电泳。

一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）

；

②凝

胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）

。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中

聚丙烯酰胺的浓度及

pH

的不同，即不连续性所致）

。因此，样品分离效果好，分辨率高。

SDS

即十二烷基硫酸钠（

Sodium 

Dodecyl 

Sulfate

，简称

SDS

）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例

和蛋白质结合，形成一种

SDS-

蛋白质复合物。

这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原

来的电荷，

从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。

与此同时，

蛋白质在

SDS

作用下结构

变得松散，

形状趋于一致，

所以各种

SDS-

蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，

仅仅取决

于蛋白质的分子量。另外，

SDS-

蛋白质复合物在强还原剂

（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫

键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在

15KD

到

200KD

之间时，蛋白质的迁移率

和分子量的对数呈线性关系，符合下式：

logMW=K-bX

，式中：

MW

为分子量，

X

为迁移率，

k

、

b

均

为常数。

本实验采用化学聚合法制胶，

进行不连续的凝胶电泳，

并用考马斯亮蓝快速染色，

以分离和鉴定大肠

杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。

【试剂与器材】

（一）试剂（

(

全班分两大组，每组配一份，如

1

－

5

组一份，

6

－

10

组一份

) 

（

1

）

30% 

的凝胶贮备液：

ACR 30g + Bis 

0.8g 

溶于

100 mL

去离子水中，用

3

号新华滤纸过滤至棕

色瓶中，

4

℃

避光贮存（

1

）

。

（

2

）

3mol/L Tris-buffer,pH8.9

：

Tris base 36.6 g + 1 mol/L 

HCl 48 mL + ddH₂O 

至

100 mL

）

（

3

）

0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 

6.05g Tris base 

溶于

40mL ddH₂O

中，加

1mol/L HCl 48mL, 

加水补至

100mL. 

（

4

）

5

×

Tris-

甘氨酸电泳

buffer

（

pH8.3):

（配

1L

）

Tris-base 15.1g + 

甘氨酸

94g + 5g SDS + H2O

至

1L

（用时稀释

5

倍）

。

（

5

）

10% SDS:

：称

10

克

SDS

溶解于

100mL

去离子水中，贮存于室温中。

（

6

）

TEMED

（四甲基乙二胺）

：浓度

10%

，

20 mL (

全班共用

)

，

4

℃保存。

（

7

）

10% AP

（过硫酸铵）

：

10 mL

，新鲜配制，分装至

1.5mL 

离心管中，－

20

℃保

存待用（

2

）

。