专题关键词：

Reducing agents 还原剂；DTT 二硫苏糖醇；DTE 二硫赤藓糖醇；TCEP Hydrochloride 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐；GSH 还原型谷胱甘肽；GSSG 氧化型谷胱甘肽；Cleland’s reagent 克莱氏试剂；Antioxidant 抗氧化剂；GSH/GSSG；

基本介绍：

还原剂（Reducing agents）主要用于还原蛋白和多肽中的二硫键，也可用来降低蛋白聚集从而利于蛋白结晶。还原剂通常会与样本中的金属离子反应，导致还原剂性能降低。条件允许情况，可在体系中加入金属螯合剂如EDTA，以去除所有不必要的金属离子。然而，某些实验有些酶功能的激活离不开金属离子。像BME对铜离子、钴离子和许多磷酸盐缓冲液很敏感。DTT对镍离子很敏感，因此，进行镍离子相关的亲和纯化实验要注意。还原剂的种类非常多。

生物化学和分子生物学中，常用的有BME（β-Mercaptoethanol，β-巯基乙醇），二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE），和三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl），目前来说最受欢迎的莫过于DTT，已逐渐替换传统的BME；而TCEP作为新开发的还原剂，也以更佳的稳定性、更广的兼容性，和更高的还原能力，慢慢被科研工作者所重视，来替换DTT。

细胞生物学研究中，常用的为GSH（Glutathione, Reduced），一种极其重要的抗氧化剂，用以保护细胞和组织免受活性氧导致的损伤。GSH/GSSG比率是用来反映细胞和组织氧化应激的重要指标之一。

几种还原剂的特征描述：

1. 巯基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME，BME）

典型特征：只含有一个巯基，还原性最差，还原作用只能维持2-3天，挥发性强。1970年前广泛使用，由于恶臭（臭鸡蛋味），之后迅速被DTT替代。溶液中BME一旦接触空气会迅速被氧化成一个二硫化物，特别碱性pH环境。正由于这一特性，BME广泛用来保护蛋白，特别是酶，保持其活性。加入过量BME（通常0.01M）能维持蛋白巯基处于还原态。

应用：通常以5%浓度加入SDS-PAGE凝胶的上样缓冲液。裂解分子间（亚基间）的二硫键从而使蛋白质亚基在SDS-PAGE上各自分开。裂解分子内（亚基内）的二硫键使亚基完全变性，从而保证每个肽按照其链长迁移而不受二级结构的影响。

2. 二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）

典型特征：含有二个巯基，还原性强于BME，作用能维持3-7天，挥发性弱。两者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，其在pH 6.5-9.0内都具有活性。通常情况，使用DTT (100 mM)所需的浓度是使用β-ME(5% v/v, 700 mM)所需浓度的七分之一。

应用：1）用作还原剂（通常用来还原蛋白和多肽中的二硫键，防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成。）；2）用作抗氧化剂（保护活细胞免受离子辐射的伤害）；3）用作巯基化DNA的还原剂（巯基化DNA末端的硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是氧气存在情况。二聚化能明显降低后续偶联反应的效率，比如生物传感器金离子上的DNA固定化）；4）保持谷胱甘肽处于还原态；5）用作解毒剂（antidote）维持解毒系统的活性；5）参与细胞代谢比如囊泡形成，细胞形态特征，信号转导通路（激素样作用）等；6）用在如胱氨酸贮积症，或由于离子或金属毒性导致的疾病治疗过程中。

3. 二硫赤藓糖醇（Dithioerythritol，DTE）

典型特征：DTE是DTT的差向异构体（epimer），结构比较见下。

应用：同DTT，DTE也是一种优秀的还原剂，其还原性可能稍稍弱于DTT。

4. 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）

典型特征：TCEP，还原性最强，作用可维持2-3周。pH范围广，且无臭味。且兼容性好。在很多应用大已慢慢的替代DTT。

应用：1）用作还原剂（通常用来还原蛋白和多肽中的二硫键，防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成）；2）用作许多重金属离子如Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)和Ni(II)的螯合剂。

以下表1，是对DTT&TCEP的特征和功能的一一比较：

DTT 二硫苏糖醇

TCEP 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

货    号               

MS5510-10G

MS5512-1G

CAS NO.

3483-12-3

51805-45-9

同义名

(±)-threo-1,4- Dimercapto-2,3-butanediol; 1,4-Dithio-DL-threitol; Cleland Reagent racemic; DL-二硫苏糖醇；1,4-二巯基苏糖醇；克莱兰氏试剂；

TCEP-HCl; Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride;三(2-羰基乙基)磷盐酸盐；三(2-羧乙基)膦盐酸盐；

分子量

154.2

286.65

分子式

C4H10O2S2

C9H15O6P · HCl 

外观

微弱巯基气味，白色晶体粉末

无臭，白色晶体

溶解性

50g/L

310g/L

稳定性

不挥发，室温稳定；在水溶性缓冲液、酸性和碱性溶液中都稳定。

2-8ºC可稳定保存高达3年；≤72h稳定保存，无明显的降解或氧化。

简单描述

DTT是一种将二硫键-S-S还原为-SH基团的保护剂。可用作蛋白和酶的还原剂。

TCEP-HCl具有无臭的优势，一种非常强效还原剂，一种不可逆还原剂，有更强的亲水性、和抗空气氧化性。几乎能完全还原二硫键。

降解性

当DTT处于30ºC，3天后开始呈现降解之势，而5天后降解速度明显加快。对镍离子很敏感。

TCEP-HCl在磷酸盐缓冲液，特别是中性pH环境，非常不稳定。由于TCEP在溶液中带电荷，因此不可用在等点聚焦。

有效pH范围

当pH>7才可维持还原性。pH 7条件下的氧化还原电势为-0.33 V。

在更低或宽广pH范围皆有效。优化pH范围是1.5-8.5。溶于水产生的pH约为2.5。

是否需要去除

需要过滤去除（当以固相催化剂形式）或色谱去除（当以液体形式使用）

大部分实验前没有必要提前去除TCEP，比如his-tag重组蛋白纯化。

应用

DTT是巯基化DNA的还原剂或“去保护剂”。适用于电泳分析。

在蛋白应用、SDS-PAGE和质谱应用上很受欢迎。不会还原固相金属亲和层析系统内的金属离子。常用作一种还原剂以打破蛋白内或蛋白间的二硫键，以用在凝胶电泳、his-tag蛋白纯化和马来酰亚胺偶联反应。

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TCEP Hydrochloride 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

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TCEP Hydrochloride 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

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β-Mercaptoethanol (β-ME)  β-巯基乙醇

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5. 还原型谷胱甘肽（Glutathione, Reduced，GSH）

基本描述：

谷胱甘肽（Glutathione），一种小分子巯基多肽，在人体内以两种形式存在，还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），两者在相应的生理反应和酶催化下实现转化，GSH/GSSG比率常用作反映细胞和组织氧化应激的一种重要指标。

还原性谷胱甘肽，英文名Glutathione, Reduced，缩写为GSH，CAS NO. 70-18-8，普遍存在于动植物、真菌、一些细菌和古生菌中的一种重要抗氧化剂，保护细胞免受活性氧比如自由基、氧化物和脂质过氧化物造成的损伤。GSH是一种内源性三肽，发现于生物体内最主要的一种非蛋白硫醇，可提供电子还原细胞质蛋白通过半胱氨酸残基连接形成的二硫键，维持蛋白的还原状态。此过程中GSH也被氧化为GSSG。之后，通过谷胱甘肽还原酶（GS）的作用，以NADPH为电子供体，GSSG又被还原为GSH。GSH具有多种代谢、调控和保护功能。还可用作乙二醛酶I的抑制剂。

应用：

GSH用作还原剂，主要的功能也体现在细胞培养系统中。见下：

1. 保护细胞免受氧化应激带来的损伤，使得胞内和胞内都保持在一种良好的氧化还原状态。提供还原当量再生巯基化合物和抗氧化剂，同时转化过氧化物到水或醇中。氧化型谷光氨肽（GSSG）能被谷胱甘肽还原酶快速还原，在正常的体内或者血清中几乎没有氧化形式的GSSG存在。

2. 谷胱甘肽是许多硒化蛋白的首选底物，在胞内和胞外环境起到解毒功能，通过将过氧化氢转化为水，或者将有机过氧化物转化为水和有机醇。若是不能去除，这些氧化物和过氧化氢最终会形成反应性的羟基、过氧和烷氧自由基。

3. 谷胱甘肽还原胱氨酸和半胱氨酸混合的二硫化物，产生半胱氨酸。保证半胱氨酸用作一种底物以形成蛋白，以及谷胱甘肽。

4. 谷胱甘肽再生抗血酸盐，一种重要的维生素，参与铜离子动员，细胞贴壁，氨基酸代谢和抗氧化。间接有利于维持细胞膜的抗氧化活性。

5. 谷胱甘肽通过谷光氨肽S-转移酶的作用，对脂质过氧化和/或糖氧化过程中产生的醛类进行解毒；

6. 谷胱甘肽可能用作一种非毒性和稳定的半胱氨酸储存池，以进行蛋白合成；

7. 保证胞内蛋白巯基基团的还原态，从而有利于蛋白的分泌表达；

8. 某些细胞使用特殊的氨基酸膜转运系统，其活性依赖γ-谷氨酰转移酶。谷胱甘肽是其首选底物，有利于转运其他氨基酸进入细胞。

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Glutathione, Oxydized (GSSG) 氧化型谷胱甘肽

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Glutathione,Reduced (GSH) 还原型谷胱甘肽

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Glutathione,Reduced (GSH) 还原型谷胱甘肽

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注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。