朋友们！不管是哪家试剂盒那种方法，原理都差不多，作用都一样。所以，我们来从头捋一捋问题都处在了哪里！

Step 1：提取总蛋白。（以2个样品为例）

Step 2：配置BCA：8个标准曲线孔+2个样品孔+1（多配一个孔）=11个孔

                                96孔板每孔＋200μl BCA混合液

                                因此你需要配置11×200=2200μlBCA

（~~~教师弟师妹们做实验的时候他们的计算能力超出了我的认知~~~）

                  A液：B液=50：1

                  A液2157μl+B液43μl （当然，你也可以A液2200μl+B液44μl，节省不在于这1μ2μ，重点在于好算）。混匀后六孔板每孔200μl。

Step3：加样

样品＋2μl的原因：因为做标曲时PBS+标准蛋白一共加了20μl，样品应该也＋20μl。But!!!提蛋白不易，谁舍得加20μl用来测浓度，所以，我们加2μl样品+18μlPBS，相当于稀释十倍。也就是说，测出的浓度最后要×10才是实际浓度。

Step4：37℃孵箱孵育30min。酶标仪检测。波长562nm。（怎么设置就不说啦~毕竟各个实验室仪器不一样设置方法不同）

Step5：测完浓度后开始配成等体积等浓度，用于跑wb。推荐上样量20~40μg。10孔推荐上样体积15~20μl。因为我们实验室用的6×loading buffer，为了方便计算，我一般上样体积为18μl。若实验室用5×loading buffer，可以上20μl。

      计算如下：

以上是以1次的量为例。最后配的时候每个量都要×总道数。注意：总道数即为你需要跑几次。记得多配半道！

我一般会制作一个表格，放在桌面上，每次测完直接把浓度抄进去，这样就不用每次都算啦~像这样：

有了这个表格，感觉每次配蛋白时神清气爽，再也不担心不小心算错了，只要记得公式别输错就好啦~

Step4：混匀！煮蛋白变性！就OK了！

小tips：

关于标准曲线的问题，我一般建议做八个点，浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml（1mg/ml=1μg/μl，我感觉这个是数学问题，大家都是理科生，但实验室有师姐真的问过我：你测出来mg/ml，怎么变成μg/μl了），标曲的R2最好是0.99以上，这样测出来的浓度比较准。一般情况下手稍微不稳，可能会有两个孔偏差比较大，这时候可以去掉这两个，仍旧有6个点定标，还算比较准。好多人都嫌麻烦只5个孔或者更少定标准曲线，加样准还行，不准的话又得重做。加样的时候保持心平气和，让师弟师妹不要跟你说话，吸完每一枪都看一下量对不对，加进去二档抽吸混一混，加样完看枪头有没有挂壁太多。一定要注意，你要是R2=0.98但你实在做不到0.99了也可以凑活用一下，但是！R2要是都小于0.9了拜托千万不要浪费蛋白样品了，我还见过R2=0.5的，跑完wb问我内参为啥特别不齐··🙂为了实验室团结，我只能保持微笑。

好了，关于BCA法蛋白定量的分享就到这里，祝你们的内参从此整齐漂亮没有趋势！