科研

2023-08-01 00:03| 来源: 网络整理| 查看: 265

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编译：微科盟蓝胖儿，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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导读蚯蚓在陆地生态系统中对有机物的分解起着重要的作用。蚯蚓直接与微生物相互作用，通过肠道运输影响有机物的分解，即前肠和中肠对有机物的消化和同化以及后肠对有机物的排泄。然而，蚯蚓摄入的微生物群落如何响应蚯蚓不同肠段的转运过程尚不清楚。采用堆肥牛粪饲喂蚯蚓，并采集蚯蚓粪和蚯蚓前肠、中肠和后肠内容物进行细菌16S rRNA基因测序分析。蚯蚓肠道转运降低了变形菌门和拟杆菌门的丰度，增加了放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门的丰度。富集分析结果显示不同肠段对摄入的细菌群落有不同的选择性刺激和抑制作用，并延伸至蚯蚓粪。FAPROTAX数据表明，蚯蚓肠道中富含C和N代谢微生物。参与发酵和产甲烷的微生物在后肠富集，反硝化微生物在前肠富集。蚯蚓肠道转运刺激后，蚯蚓粪中的N代谢微生物显著增加（P < 0.05），动植物病原微生物受到抑制。结合随后的相关性和生化分析结果，蚯蚓肠道转运显著改变了细菌群落的结构和功能，加速了有机质的降解矿化和磷、钾的富集。本研究表明，蚯蚓的肠道转运过程在调节陆地生态系统中的有机物动态方面起着重要作用。

论文ID

原名：Variations in bacterial taxonomic profiles and potential functions in response to the gut transit of earthworms (Eisenia fetida) feeding on cow manure

译名：以牛粪为食的蚯蚓（赤子爱胜蚓）肠道运输过程中细菌分类特征和潜在功能的变化

期刊：Science of the Total Environment

IF：7.963

发表时间：2021.4.29

通讯作者：王辉

通讯作者单位：中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室

实验方法

蚯蚓在堆肥牛粪中培养，在22℃的气候室中湿润至其持水能力的80%，进行30天的适应。然后，选择200只成年蚯蚓进行正式实验，收集了四个堆肥牛粪样品（CM1-CM4），每个样品的一半保存在80℃用于DNA提取，另一半用于理化性质分析。将蚯蚓加入4个塑料盒中，每盒300 g堆肥牛粪湿润至80%，在22℃的气候室中暗培养30天。1个月后，收集蚯蚓粪样品（VC1-VC4），蚯蚓粪样品由蚯蚓粪和少量未被蚯蚓消化的牛粪混合组成。从每个盒子中随机选择30条蚯蚓，无菌解剖以提取肠道，将肠道分成前肠、中肠和后肠三部分，收集肠道内容物（ FG1-4、MG1-4和HG1-4）（图1）。测定堆肥牛粪和蚯蚓粪样品的含水量、有机物、总氮、碳氮比、总磷、总钾、硝态氮、铵态氮和微生物生物量碳；然后对所有样品进行DNA提取、PCR扩增，Illumina MiSeq测序和扩增子序列处理。

图1 蚯蚓消化牛粪的过程简图。取样：前肠（FG）、中肠（MG）、后肠（HG）。

结果

1 细菌群落的组成

前7个门约占总ASV丰度的96%（图2和表S2）。CM组、VC组和肠道切片组（FG组、MG组和HG组）间丰富的类群不同。CM组的优势类群为拟杆菌门（~33%）和变形菌门（~56%）。CM被蚯蚓摄食后，FG中拟杆菌门和变形菌门的相对丰度下降，MG和HG中恢复~13%，VC中恢复~36%。虽然VC中放线菌门（~11%）的相对丰度显著高于CM（~2%）（图2和表S2），但厚壁菌门和放线菌门的相对丰度与拟杆菌门和变形菌门的相对丰度呈相反趋势（图2和表S2）。其他门的相对丰度均有不同程度的增加，如绿弯菌门（~1.3-23%）和酸杆菌门（~0.17-5%）（图2和表S2）。

图2 优势细菌门的相对丰度。堆叠条形图上的百分比标记代表每个样本组中门的平均相对丰度（> 1%），n = 4。CM：堆肥牛粪；FG：蚯蚓前肠内容物；MG：蚯蚓中肠内容物；HG：蚯蚓后肠内容物；VC：蚯蚓粪。2 细菌群落多样性Shannon指数揭示了蚯蚓肠道运输过程中细菌α多样性的显著变化（图3A，P < 0.05）。Shannon指数在VC中最高，MG中最低，而CM、FG和HG之间差异不显著（所有Ps > 0.05，图3A）。就细菌β多样性而言，堆肥牛粪、蚯蚓肠道和蚯蚓粪的微生物群落具有明显的聚集性（图3B）。基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA测试支持上述结果，表明MG和HG组之间的细菌群落结构没有显著差异（P > 0.05，表1）。

图3 细菌群落多样性。（A）：α多样性，Shannon指数数据以平均值±标准误表示（n = 4）；（B）：β多样性，基于Bray-Curtis距离的ASV水平上的PCoA。缩写见图2。表1 基于Bray-Curtis距离对不同组间细菌群落组成的PERMANOVA检验。

所有组：F值：18.95，P值：0.0001。每一栏都有不同的字母。CM：堆肥牛粪；FG：蚯蚓前肠内容物；MG：蚯蚓中肠内容物；HG：蚯蚓后肠内容物；VC：蚯蚓粪。*表示不同组间差异显著（P < 0.05）。 3 显著富集的ASVs与不同蚯蚓肠段和蚯蚓粪的关联采用差异ASV丰度分析，对富集的ASVs、减少的ASVs和无显著变化的ASVs进行鉴定，FG、MG、HG、VC和CM之间存在群落分离。VC是最具排他性的一组，减少了576个ASVs，富集了963个ASVs（表2）。虽然肠道中富集的ASVs数量较低，但在肠道环境和蚯蚓粪中，减少的ASVs的数量没有明显差异（表2）。在肠道相关组中，MG富集ASVs的比例最低，而减少的ASV的数量略高于FG和HG（表2）。成对比较表明，肠段中的大多数ASV没有显著变化（98-99%），尽管与肠段相比，VC中富集（1275）或减少（564）的ASVs的数量远大于未发生显著改变的ASVs的数量（183，表2）。表2 蚯蚓肠道运输过程中富集、减少和无明显变化的ASVs数量。

CM：堆肥牛粪；FG：蚯蚓前肠内容物；MG：蚯蚓中肠内容物；HG：蚯蚓后肠内容物；VC：蚯蚓粪。在肠道环境和蚯蚓粪之间存在显著重叠和不重叠的差异丰富的ASVs，与CM相比，FG、MG、HG和VC中分别有122、37、66和927个独特富集的ASVs，且所有组中只有17种富集ASVs是共有的（图4A）。然而，几乎所有FG减少的ASVs在MG、HG和VC中也减少了（图4B）。LEfSe结果显示，FG和MG中富集了3个放线菌纲目（Micromonosporales，Streptosporangiales和Micrococcales）和2个厚壁菌纲目（Clostridiale和Bacillales）；隶属于γ-变形菌门的气单胞菌纲在HG中富集，分别隶属于α-变形杆菌纲和绿弯菌门的根瘤菌目和厌氧绳菌纲在EC中富集（图4A和图5）。与CM相比，减少的ASVs主要由变形菌门（252 ASVs）和拟杆菌门（150 ASVs）组成（图4B和图5）。这些结果表明，不同肠段对细菌群落的选择性刺激作用是不同的，但抑制作用是一致的，并延伸到蚯蚓粪中。

图4 每个肠段和肠管都有特定富集和减少的ASVs。与牛粪相比，各肠段和铸件间差异富集（A）和减少（B）ASVs的数量。

图5 富集于牛粪、蚯蚓粪和各肠段的细菌群。LDA = 4.5。 4 潜在功能群根据16S rRNA基因序列注释，FAPROTAX共获得50个功能组，其中948个ASVs（占总ASVs的29.95%）至少被划分到一个功能组。然而，预测的细菌群落功能组成与分类组成之间存在显著的相关性（Mantel r = 0.85，P = 0.0001），表明对所有的样品都具有很好的功能预测能力。本研究首先只关注C和N代谢（图6），在堆肥牛粪通过蚯蚓肠道的过程中，我们观察到与C和N代谢相关的细菌组成发生了显著变化，只有3个功能群无显著差异（P > 0.05）（图6）。与β多样性发现一致，层次聚类树结果显示了MG和HG中的细菌C和N代谢功能谱相似，大部分C（12/19）和N（6/11）代谢功能群在蚯蚓肠道中富集。对于C代谢，FC与还原性乙酰化、纤维素分解、塑料降解、芳香化合物降解、木聚糖分解和酸呼吸相关的细菌群（隶属于放线菌门、厚壁菌门、γ-变形菌门、α-变形菌门、拟杆菌门和δ-变形菌门）的丰度显著高于MG、HG、CM和VC（P < 0.05）。与叶绿体相关的细菌群（隶属于蓝藻细菌的成员）在MG中富集，与发酵相关的类群（主要隶属于δ-变形菌门、γ-变形菌门和放线菌门）和甲烷生成相关的类群（主要隶属于产甲烷古菌）在HG中富集（P < 0.05，图6）。与化学异养和甲醇氧化相关的菌群丰度在CM中最高（主要隶属于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门）。FG、MG、HG和CM中的一些功能性细菌群也出现在VC中，并且与光养、几丁质分解和木质素分解相关的细菌群（主要隶属于γ-变形菌门、α-变形菌门和蓝藻细菌）的丰度在VC中进一步提高（P < 0.05，图6）。在N代谢方面，与反硝化和亚硝酸盐呼吸有关的细菌群（主要隶属于γ-变形菌门和厚壁菌门）在FG中富集。硝酸盐还原菌群（主要隶属于γ-变形菌门、α-变形菌、厚壁菌门和放线菌门）在MG和HG中富集。VC中尿素分解、好氧亚硝酸盐氧化、厌氧氨氧化、硝化、好氧氨氧化和固氮的菌群（主要隶属于γ-变形菌门、α-变形菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门）丰度显著高于FG、MG、HG和CM（P < 0.05，图6）。

图6 潜在的细菌C（左）和N（右）代谢功能概况。从蓝色到红色的颜色代表每组预测函数的平均相对丰度。符号*和**表示各组间在P < 0.05和P < 0.01时具有显著和极显著差异。缩写见图2。采用Spearman相关分析评估细菌群落多样性与C、N代谢相关的功能菌群之间的关系（图7）。在C代谢方面，α多样性与光异养、木质素分解、甲醇氧化、几丁质分解、光养和光自养显著正相关，与纤维素分解和发酵显著负相关（P < 0.05）。β多样性也与光养、甲醇氧化和几丁质分解呈显著正相关，与C代谢相关的剩余功能菌群呈显著负相关（P < 0.05）（图7）。对于N代谢，α和β多样性与硝化、厌氧氨氧化、好氧氨氧化和亚硝酸盐氧化显著正相关（P < 0.05）。α多样性与氮和硝酸盐呼吸呈显著负相关，β多样性与反硝化作用呈显著负相关（P < 0.05）（图7）。我们随后评估了其他代谢组，CM中与植物病原体，人类病原体和无脊椎动物寄生虫（主要是变形菌门和衣原体门的成员）相关的细菌群的丰度显著高于FG、MG、HG和VC（P < 0.05），以及几乎所有与S代谢相关的菌群（主要是隶属于变形菌门和厚壁菌门）在EC中富集（图S1）。HG中与铁呼吸和锰呼吸相关的细菌类群（主要隶属于厚壁菌门和变形菌门）的丰度高于FG、MG、CM和VC，但锰氧化细菌类群（隶属于厚壁菌门）在HG中显著富集（图S1）。

图7 Spearman相关分析的热图。细菌群落多样性与潜在的C（A）和N（B）代谢的相关性。蓝色和红色分别表示正相关和负相关。颜色密度和数字反映了相关性的程度。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。

讨论

1 细菌群落分类组成的变化本研究结果表明，在赤子爱蚯蚓的肠道转运过程中，细菌群落组成发生了显著变化。我们的数据显示，蚯蚓肠道充当选择性生物过滤器，选择性地刺激和抑制摄入的细菌池。结果表明，不同蚯蚓肠段对菌群有特定的刺激作用，但对菌群的抑制作用基本相同，并延伸到蚯蚓粪。蚯蚓肠道运输过程中观察到的选择性效应的差异可能有两个原因：（1）各肠段原位条件不同；（2）蚯蚓肠道内菌群之间的竞争。最初，蚯蚓肠道中独特的厌氧条件刺激了与厚壁菌门和放线菌门相关的厌氧菌的积累。在蚯蚓肠道中观察到高含水量、接近中性的pH和高浓度的有机化合物，这类似于一份报告，该报告得出结论认为，肠道中的C/N明显低于土壤或有机基质，但葡萄糖、甲酸盐和氨基酸的含量明显更高，铸件中的pH值和营养状况与肠道相似。然而，在本研究中，由于蚯蚓粪中的铸件处于老化状态，一些不稳定的养分也被消耗，并且有机质含量和碳氮比明显低于堆肥后的牛粪（表S1）。因此，蚯蚓肠道环境为共营养菌群（厚壁菌门、放线菌门和变形菌门）提供了理想的条件，该阶段的C周转速度较快。在蚯蚓粪中，共营养型菌群被寡营养型菌群（酸杆菌门、绿弯菌门和变形菌门）取代。厚壁菌门和放线菌门是蚯蚓肠道中的优势门，这可能是因为厚壁菌门（如芽孢杆菌目）和放线菌门（如微球菌目）的成员可形成孢子，孢子的萌发可能被前肠中的糖和氨基酸激活。被砂囊分解并被粘液修饰的有机碎屑在前肠堆积，放线菌门的成员更喜欢有机碎屑进行次级代谢。因此，从前肠到后肠有机碎屑含量的减少可能是由于放线菌数量的减少。放线菌的次级代谢也产生许多厚壁菌门成员敏感的抗生素，并且随着这些抗生素在中肠和后肠的积累，厚壁菌门成员的丰度逐渐降低。与厚壁菌门不同，变形菌门的成员，包括假单胞菌目和根瘤菌目，对这些抗生素具有抗性，并且变形菌门的营养获取能力比其他门更强，这可能导致变形菌门的丰度增加。这些富集的细菌在蚯蚓肠道中获得自身生长所需的不稳定养分，帮助蚯蚓分解复杂的有机物，为蚯蚓提供养分，促进蚯蚓在养分贫乏的土壤中生存，这表明蚯蚓的肠道转运是一个互惠互利的过程。由于观察到在牛粪中占主导地位的变形菌门和拟杆菌门的丰度下降，一些隶属于拟杆菌纲和δ-和γ-变形菌纲的细菌可能被蚯蚓用作食物或被蚯蚓肠道中的厌氧微环境或某些抗菌物质抑制。就蚯蚓粪而言，变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门是优势类群，这与以前对E. andrei蚯蚓粪中细菌组成的研究结果相对相似，还有Lumbricus rubellus、深土栖类蚯蚓L. terrestris和内栖类蚯蚓A. caliginosa。这些结果表明，蚯蚓粪中细菌类群的分布是均匀的。从上述菌群对复杂有机物的降解情况可以看出，初始基质中的可降解有机物得到了很好的稳定。 2 细菌群落多样性的变化消化过程中微生物组成的变化极大地影响了细菌α多样性，与堆肥牛粪相比，前肠和中肠区域的细菌α多样性降低，后肠中的细菌α多样性恢复，然后在蚯蚓粪中进一步增加。尽管蚯蚓中肠和后肠的细菌群落结构相似，但细菌β多样性（PCoA）结果在其余检测组之间显示出显著差异（P < 0.05）。这些发现与先前研究的实验结果相对一致，这表明前肠和中肠比后肠抑制更多的细菌分类群。前肠和中肠抑制的分类群多于刺激的分类群，后肠和蚯蚓粪则相反。一些研究调查了微生物对蚯蚓消化液的反应，发现前肠和中肠提取液具有很强的选择性杀菌活性，而后肠提取液则没有。结果表明，在前肠和中肠受到刺激后存活的肠道微生物和其他细菌开始在后肠繁殖，并在蚯蚓粪中积极生长。同时，在千足虫、苍蝇和线虫的消化道中检测到了杀菌活性和抗微生物物质。因此，这些结果加强了蚯蚓的肠道运输塑造了细菌群落结构的概念，并且结合微生物生物量碳数据，可能部分解释了为什么蚯蚓活动导致细菌活性降低但大大增强了细菌多样性。 3 细菌功能群的变异热图结果表明，蚯蚓（E. fetida）在肠道运输过程中，细菌功能群发生了较大的变化。我们的数据支持先前一些研究的结论，即蚯蚓肠道的原位条件（缺氧、相对中性pH值和高浓度的有机基质）是摄入微生物厌氧代谢的理想条件，其中发酵和反硝化是最显著的厌氧代谢过程。异生生物降解（纤维素分解、塑料降解、芳香化合物降解和木聚糖分解）和反硝化功能群在前肠比其他部分高得多，发酵和产甲烷功能群在后肠更丰富。这些结果表明，前肠区主要将大分子有机物转化为小分子营养物质，中肠和后肠主要吸收和同化小分子营养物质。堆肥牛粪和蚯蚓粪的生化特性表明，蚯蚓肠道运输后，堆肥牛粪中有机质含量（416 g·kg-1）和C/N（19.24）分别显著降低至蚯蚓粪中的127 g·kg-1和9.69（P < 0.05）（表S1）。OM和C/N值越低，TP和TK等其他元素的降解和富集程度越高（表S1）。综上所述，蚯蚓的肠道转运加速了C矿化过程，这解释了为什么蚯蚓能大大促进有机物的降解。蚯蚓肠道转运后，蚯蚓粪中尿素分解、厌氧氨氧化、亚硝酸盐/氨氧化和硝化等N循环功能基群显著富集。这些官能团的富集可能是因为新鲜的蚯蚓铸件被排入需氧环境时，蚯蚓粘液中有一种特殊的一氧化氮和大量的厌氧代谢产物（如NO2和有机酸），这些需氧代谢官能团受到这些条件的刺激，可能在蚯蚓粪中变得更加活跃，以促进氮养分的矿化。我们的发现与其他报道一致，即蚯蚓铸件或蚯蚓粪富含铵态氮和硝态氮（表S1）。基于这些结果，我们推测，在土壤中掺入蚯蚓粪补充了大量的有效养分，并进一步刺激相关微生物的活性，以促进土壤中养分的释放。细菌群落多样性与C、N代谢途径的相关性分析表明，与细菌多样性显著正相关或负相关的功能类群分别是蚯蚓粪和肠道中富集的类群，说明蚯蚓肠道转运改变了细菌群落的多样性和结构，促进了有机质的降解和氮营养的矿化。这些结果还表明，一些预测的动植物相关致病功能群在堆肥牛粪通过蚯蚓肠道运输后消失。尽管蚯蚓肠道中富集了一些类群，但在蚯蚓粪中很少观察到这些类群。以前的一些研究使用蚯蚓堆肥来处理有机废物，如生活污泥、厨房垃圾和牲畜粪便，并观察到类似的结果。由此可见，蚯蚓肠道对相关动植物致病菌群的抑制作用。FAPROTAX数据库虽然提供了微生物功能类别的一些信息，但它只是一个预测工具，只预测具有特定功能的可培养微生物的信息。因此，未来对微生物功能的详细研究应采用测序分析方法，如功能基因扩增和宏基因组学。

本研究深入研究了以堆肥牛粪为食的蚯蚓（E. fetida）肠道运输响应的细菌分类特征和潜在功能的变化。总之，本结果表明蚯蚓的肠道运输导致牛粪和蚯蚓粪的生化特性存在显著差异。在肠道转运过程中，细菌群落的组成、多样性和结构发生了显著变化。蚯蚓不同肠段对菌群有选择性的刺激和抑制作用，这种作用可能延伸到蚯蚓粪。蚯蚓不同肠段通过改变微生物群落的组成和功能，促进氮营养元素的矿化以及磷和钾营养元素的富集，从而影响陆地生态系统中有机质的降解和养分循环。

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