赤霉素(Gibberellins，GA)是一种天然的植物生长调节剂，与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯被称为植物五大激素[1]。1934年，GA由日本学者从恶苗病菌的发酵滤液中得到，并于1938年正式命名为GA。至今已发现不同结构的GA有136种，总称赤霉素类(GAs)[2]。具有生物活性的GA主要有GA1、GA3、GA4、GA7等，它们的化学结构如图 1所示[3-4]。

研究表明，GA对植物生长具有多种调控功能，可促进茎的伸长、诱导植株开花、打破种子休眠、增强植物抗性等[6-7]，因而在农业、林业、食品酿造等方面有着巨大的应用潜力。植物、细菌和真菌的代谢物中均有GA产生[8-10]，但在微生物体内的生理作用尚未研究透彻。

目前GA可通过化学合成、植物提取和微生物发酵三种方式获得。因为前两种方式成本高、效率低，而微生物发酵法周期短、效率高，所以微生物发酵法被广泛应用于工业大规模生产[5]。目前，藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi W.为有性态，无性态为藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi)是工业生产的主要菌种，国内GA3工业生产水平在1 200–2 000 mg/L，国外深层液态发酵可达到3 900 mg/L[11]，GA4国内产量大约在600– 800 mg/L[12]，但随着GA的应用越来越广泛，其产量已远远不能满足市场需求，因此探索提高GA产量的方法十分必要。GA的生物合成途径是一个多种酶参与的复杂过程，因此对途径中关键酶及酶基因的研究是实现GA定向调控必不可少的，再加上基因技术的不断发展，利用基因工程菌生产GA已成为研究热点。本文就G. fujikuroi中GA的合成途径和相关酶及代谢调控研究进展进行综述，以期为提高GA的产量提供思路。

G. fujikuroi中GA的生物合成途径[13-14]已研究得较为清楚(图 2)，主要包括3个阶段：牻牛儿牻牛儿焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)的合成、由GGPP合成GA12醛、GA12醛转化为其他种类的GA。

该阶段是G. fujikuroi中GA合成的第一阶段，其中GGPP是二萜类化合物的共同合成前体，首先以内源乙酰-CoA[4]为底物，在3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)的催化下生成GA的前体物质甲羟戊酸(Mevalonic acid，MVA)，再生成异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)、二甲基丙烯焦磷酸(Dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP)、牻牛儿基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，FPP)，IPP与FPP相接，形成GGPP，这是二萜的共同前体[8]。

第二阶段GA12醛的合成过程中，GGPP经过古巴焦磷酸合成酶(Copalyl pyrophosphate synthase，CPS)、内根-贝壳杉烯合成酶(ent- kaurenesynthase，KS)的催化，生成内根-贝壳杉烯。高度疏水的内根-贝壳杉烯在细胞色素P450-4、P450-1单氧酶的一系列催化下生成内根-贝壳杉烯酸、GA12醛[15]。

在该阶段GA可通过P450氧化酶同工酶的氧化，生成一系列不同种类的GA。首先GA12醛在P450-1酶的作用下，经羟基化生成GA14醛，之后转化为GA14[16]。GA14由P450-2酶催化转化为GA4[17]，GA4既可以在1, 2-去饱和酶的作用下转化成GA7，又可在P450-3酶的作用下转化为GA1。最后，GA7在P450-3酶的作用下生成GA3。

HMGR是GA生物合成途径中第一个限速酶，也是GA等萜类代谢过程中的关键调控位点，催化HMG-CoA形成MVA[18]。Giordano等[19]研究GA、胡萝卜素合成途径时发现，洛伐他汀(Lovastatin)作为该酶的抑制剂，只对GA的积累有作用，却不影响胡萝卜素的积累和菌丝生长，说明有两种不同的合成路径在该菌株体内。通过分子杂交、PCR扩增等表明合成基因是同一的，但存在对Lovastatin的亚细胞结构障碍。有研究发现HMGR是由hmgr-1、hmgr-2、hmgr-3这3个基因组成的基因家族所编码，且基因家族不同成员的表达量影响MVA途径中“碳流”的变化，从而造成萜类产物的种类和产量不同[20]。Albermann等[21]发现，hmgr编码的HMGR由两部分组成，分别为具有8个跨膜区域的疏水性N端结构域和亲水性C端结构域，对hmgr的C端序列进行超表达，结果显示GA3效价比亲本菌株增加260%。MVA途径存在于所有萜类化合物的合成过程中，穗槐二稀同GA一样，同属于萜类化合物，Keasling等[22]通过实验证明，HMGR是穗槐二稀生成过程中的限速酶，而且在酵母中过表达tHMGR后，穗槐二烯产量大幅度提高，说明通过增加MVA代谢流可以作为提高GA产量的一个新思路。

GGPPS同HMGR、FPP合成酶(FPPS)共同参与调控GGPP的生成。Tudzynski等[23]敲除编码GGPPS基因ggs2后，发现该菌株不再合成GA。Albermann等[21]将ggs2超表达，GA总产量增加近135%，说明ggs2编码的GGPPS参与了GA合成的关键步骤。对G fujikuroi中GA合成途径中HMGR、FPPS、GGPPS等基因hmgr、fpps、ggs2超表达，发现hmgr和fpps超表达后的菌株GA积累水平急剧降低，可能是过多的前体物质引起了该途径的反馈抑制。

CPS/KS作为G. fujikuroi中的一种多功能合酶，同真菌中其他二萜环化酶一样，主要以双功能环化酶的形式存在[24]。在真菌中，由cps/ks编码的CPS/KS双功能酶，能够直接催化两步环化反应，使GGPP向内根-贝壳杉烯转化。而cps/ks与ggs2紧密连锁，共用一个839 bp的启动子，这可能更好地促进GGPP合成[25]，而且有研究表明，将两者同时超表达，总GA水平可提升111 mg/(L·g)[21]。

细胞色素P450酶在植物、动物、细菌和真菌中广泛存在，是自然界中含量最丰富、底物谱最广的催化酶系。Tudzynski等[23]通过PCR技术、差异基因筛选、限制酶介导的基因重组等方法发现在G. fujikuroi中，P450酶与控制GA合成的另外两个基因cps/ks、des位于同一条染色体上，组成了一个基因簇，但转录方向并不一样，该基因簇中，除P450-3外，其余均受氮源抑制，如图 3所示。Tudzynski等[26]敲除了des、P450-3，发现该敲除株只产生GA4和GA7。敲除des，则不再产生GA3和GA7，而GA1和GA4则大幅增加。只敲除P450-3，GA4和GA7的产量提高，但产物中不再有GA1和GA3。将des和P450-3同时敲除，则该菌株只生成GA4，并且其产量比野生型高7–8倍。说明des编码GA4去饱和酶，催化GA4向GA3转化，P450-3编码细胞色素P450-3单氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反应。P450-4位于des右侧，编码P450-4单氧酶，该酶催化内根-贝壳杉烯生成内根-贝壳杉烯[27]。P450-1和P450-4是共享双向启动子的转录单元，P450-1单氧酶主要催化内根-贝壳杉烯酸到GA14：7β-羟基化、氧化C-6位收缩B环、3β-羟基化、氧化C-7位，分别转化为内根-7α-贝壳杉烯酸、GA12醛、GA14醛、GA14[8]，其中3β-羟基化是代谢调控或诱变筛选获得高产GA4+7的最主要途径[28]。P450-2位于P450-1的右侧，编码P450-2单氧酶，可催化GA14 C-20位氧化，从而转化为GA4。P450-3是唯一不受高浓度氮源抑制的基因，位于最下游，编码细胞色素P450-3单氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反应[27]。

谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)是藤仓赤霉菌中合成谷氨酰胺的唯一酶，还是参与氨代谢的关键酶。研究表明，高浓度的谷氨酰胺能抑制所有氮源限制基因的表达，当GS被移除后，胞内谷氨酰胺处于较低水平，GA合成基因则会大量表达，导致GA大量合成[29]。然而有研究表明，当敲除GS的编码基因gln1后，GA水平明显下降，说明gln1涉及赤霉菌的代谢调控[30]。

腺苷酸环化酶(Adenylel cyclase，AC)是参与调节细胞内多种生理功能的膜整合蛋白，是调控真菌中环腺苷磷酸(cAMP)水平的关键酶[31]。大量研究表明，许多丝状真菌的发育、生长、抗逆等都受细胞跨膜信号cAMP转导途径的调控[32]。Michielse等[33]与García-martínez等[34]证明，在G. fujikuroi中，当敲除编码腺苷酸环化酶基因后，GA产量减少。Studt等[35]发现，AC被异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein) α亚基刺激，合成cAMP后，蛋白激酶A (Pka)被激活，进而Pka通过对目的蛋白进行磷酸化修饰来改变蛋白活性，调控G. fujikuroi代谢过程。

微生物培养基组分以及培养条件的变化均会引起GA合成代谢过程中关键酶及基因的变化，从而直接或间接调控着GA的合成代谢。

碳源作为微生物生长的物质基础，一方面为细胞生长提供必需的物质能量，另一方面也为代谢产物提供原料。葡萄糖、淀粉、蔗糖是目前最常使用的碳源，过高的碳源浓度会因代谢抑制而限制GA的合成[36]。González等[37]向培养基中添加淀粉和蔗糖的混合物能大幅提升GA产量。刘文芳等[38]认为液化淀粉是GA发酵的最优碳源。甜菜渣、糖蜜、秸秆等也可为GA生产提供碳源。刘风莉等[39]在研究串珠镰孢菌Fusarium moniliforme固态发酵产GA3时发现，在培养基中添加酶解后的秸秆，产量能得到有效提高，达到789.14 mg/kg。经研究发现，开始时高浓度的碳源会对GA3的合成产生抑制，但氮源耗尽时少量的碳源补充有利于细胞生长和GA3积累[40]。可见碳源的种类及比例对赤霉素的产量有明显的影响，因此可通过合适的碳源配比来提升赤霉素生产水平。

植物油可作为迟效碳源，不仅为微生物生长发育提供能量，还能缓解中间代谢物的阻遏效应。植物油经过培养环境中脂肪酶的分解作用，形成脂肪酸和甘油，其中脂肪酸通过代谢途径中的β-氧化，形成乙酰辅酶A参与合成。例如庄木坤等[28]认为在培养过程中添加芝麻油、橄榄油、豆油能够提升GA3的效价。在抗生素的生产中，植物油也能提高产物效价，如Park等[41]在头霉素C的研究过程中发现，8% (W/V)的菜籽油与单一碳源淀粉相比，目的产物产量提高2倍。陈贵斌等[42]发现以豆油为部分碳源进行头霉素C发酵，有利于提高产素能力。将多种植物油加到红霉素发酵培养基中，可有效提升红霉素积累水平[43]。

在G. fujikuroi的GAs合成途径中，高浓度的氮水平对GAs合成的影响尤为显著。Tudzynski等[13]克隆了areA-GF基因，该基因参与G. fujikuroi中氮代谢，而且缺失areA-GF基因的菌株只能利用谷氨酸盐和铵盐作为氮源，其GA产量较低。Mihlan等[29]证实areA-GF编码的蛋白质可以与cps/ks、des、P450-4、P450-2、P450-1、ggs2这6个基因的启动子结合。因此，areA-GF的缺失将会造成这6个受氮调控基因的表达水平下降。敲除谷氨酰胺合成酶基因glnA-GF会造成GAs和比卡菌素产量急剧下降，说明glnA-GF有可能也参与GAs的生物合成氮代谢[30]。Wong等[44]发现，在氮源充足时，areA的活性受meaB与nmrA的影响。氮源不足的情况下，敲除meaB会造成GA生物合成途径中受氮调控基因的表达量急剧提升。敲除meaB和areA则导致GA合成基因不表达，合成比卡菌素合基因提高。因此，meaB与areA相互作用，共同参与赤霉菌的氮代谢调控，且二者不可相互替代[45]。

氮源种类也影响GAs的生物合成。常用的无机氮源有氯化铵、硝酸钾、硫酸铵，有机氮源有玉米浆粉、蛋白胨[28]、豆粕粉、花生粉等[46]。王卫等[47]在培养基中加入不同种类的花生饼粉，结果表明，冷轧花生粉因含有大量蛋白大分子，而能够有效提升GA3产量。李明森等[48]在研究GA3固体发酵时发现，向含有麸皮玉米面的培养基中分别添加硫酸铵、豆粕粉、花生饼粉、硝酸钾都使GA3效价降低，这可能是因为额外添加氮源造成营养物质消耗、菌体生长过快，限制了培养基的传热与溶氧，从而造成GA3效价降低。Lale等[49]研究表明，以小麦蛋白作为氮源，其GA3效价要比脱脂豆粕作为氮源产量要低，但GA4效价却大幅提高。这说明氮源还可能对酶活性产生作用，从而导致GA种类和产量发生变化。

无机盐不仅为赤霉素积累的提供营养物质，为酶活性提供离子，还能控制氧化还原电位，平衡细胞渗透压。如储修云等[50]通过在培养基中添加镁、硼、磷等提高了GAs的效价产量。氨基酸的种类及浓度影响GA的生产，缬氨酸能降低其产量，少量的酪氨酸、谷氨酸能提高GA生产水平。维生素C也会阻碍GA3的合成[51]。在萜类的研究过程中发现，添加促进剂或诱导剂也能促进产物合成，如三孢布拉霉菌产番茄红素的发酵中，添加β-紫罗酮、青霉素等物质后，番茄红素产量能高达1.54 g/L[52]。赤霉素也是萜类的一种，但目前赤霉素关于此方面研究较少，有待于深入探究。

培养基中不同的pH值会影响一些营养物质的电离程度，当菌体摄取这些营养物质时，会造成细胞内一些大分子如核酸、蛋白质等酸碱度变化，进而使它们的生物活性发生改变。微生物的生长和次级代谢产物与pH值有非常重要的关系。对于GA3的生产，pH值大于6.0，菌株主要产GA4和GA7，小于3.5主要产GA1[14]。一方面可能是因为过高的pH导致GA4和GA7等中间代谢物分泌到胞外而不能再转运回胞内继续合成终产物GA3，另一方面可能是pH对GAs合成途径中的酶产生了影响[10]。Bilkay等[53]指出pH为5时，黑曲霉发酵GA3产量达到0.25 g/L；当pH为3和7时，GAs的产量分别为0.1 g/L和0.15 g/L。李明森等[52]发现pH为7时固体培养GA3效价最高，为9.832 g/kg。张文宣等[54]在研究GA4+7大罐生产过程中，用流加补氨水替代碳酸钙进行pH调节，结果显示，调节pH值能明显提高GA4+7效价。由此可见，pH会制约GAs的种类及含量，因此在实践生产中，可通过调节发酵过程中的pH来指导生产。

温度与微生物的生长存活密不可分，不同的温度可促进不同的酶活性，进而提升目的代谢物的积累速度。有研究指出，用串珠镰孢、G. fujikuroi作为生产菌株生产GA适宜温度有25 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃[55-58]。Jefferys[59]指出，29 ℃利于G. fujikuroi产GA3，高于29 ℃效价降低，31–32 ℃时利于菌体生长。Meleigy等[60]认为，30 ℃利于串珠镰孢产GA3，高于30 ℃效价降低，40 ℃抑制GA3积累。Escamilla等[11]研究证明，30 ℃有利于流化床培养固定化G. fujikuroi产GA。王卫等[46]发现对GA3发酵过程实施分阶段变温控制策略比恒温发酵产量提高了11.14%。因此，在GAs生产过程中，可通过菌株的种类来探究适宜的温度，从而提高GAs产量。

溶氧在微生物代谢中也发挥着巨大的作用，影响着细胞还原力NADPH和能量代谢。G. fujikuroi生长和GA合成过程都要消耗氧气，因为此途径中有大量氧化反应，如脱氢酶、双加氧酶、P450单氧酶所参与的反应都需要消耗氧气，所以足够的溶氧量必不可少[13]。在GAs实际生产中，溶氧控制一般通过增大通气量、补水、降温、提高转速、添加表面活性剂、氧载体等方式解决。Borrow等[61]发现，在培养体系中通入少量二氧化碳能显著提升GA3产量，达到0.62 g/L，而不添加二氧化碳GA3的产量仅0.42 g/L。Machado等[62]在研究固体发酵时发现，在72 h之前提供低溶氧(0.24 L/(h·kg))环境，之后提供高供氧(0.72 L/(h·kg))环境，GA3产量可达到最高。但是发酵过程中溶氧过高也会因菌体生长过快、副产物的大量生成等原因导致GAs产量降低。

过低溶氧量一方面会造成菌丝体内的代谢过程发生变化，如厌氧呼吸会产生大量的乙酸、乙醇等，对细胞产生毒害；另一方面导致pH下降、菌丝体自溶、发酵终止、效价偏低。因此，在GAs的发酵过程中，充足的溶氧量至关重要。

在G. fujikuroi的GAs合成过程中，可通过敲除分支途径关键酶基因，从而提高GAs产量，如Wiemann等[63]将藤仓赤霉中编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl transferase)的ppt1基因敲除，造成聚酮化合物合酶(PKSs)和非核糖体缩氨酸合酶(NRPSs)活性丧失，从而导致与PKSs和NRPSs相关的下游代谢反应受到阻断，代谢流向GAs合成途径转移，使GA效价得到提升。目前，赤霉素在该方向的研究较少，可借鉴相关萜类化合物的研究作为参考。如番茄红素作为萜类化合物的一种，且在基因调控方面研究较为透彻，如Miura等[64]将番茄红素合成基因crtE、crtB、crtI转入原本不产番茄红素的产蛋白假丝酵母Candida utilis后，该菌株开始产生番茄红素，通过切断其竞争途径麦角固醇的代谢通路，并使HMGR过表达，最终番茄红素产量提高7倍[65]。

前体物是指加入到培养基中，能被微生物直接利用或参与目标产物的生成，通常有脂肪酸、柠檬酸、糖类、C1化合物等一些初级代谢产物。

微生物在经过长期的进化演变，其代谢通常不产生多余的物质，调控点通常控制初级代谢分支首个酶的活性或合成，而添加前体物可以令次级代谢过程避开初级代谢对目标产物的调控。

但前体物的添加浓度不可过高，对菌有毒害作用，从而影响目标代谢物产量，过低则作用不显著。因此，前体物调控策略的研究对实现GAs高产稳产十分必要。Cihangir[66]以MVA作为前体物加到浸没培养的黑曲霉Aspergillus niger中，探究MVA对该菌的生长和GA3产量的影响，发现添加少量MVA使GA3的产量提高近50 mg/L。王卫等[67]发现在培养基中添加草酰乙酸、维生素B2、葡萄糖酸钙能够大大提高GA3产量。目前，前体物质影响GA合成的相关研究较少，可通过其他萜类物质的相关研究，为提高GAs产量提供思路，如萜类化合物紫杉醇的培养过程中，添加前体物苯甲酸钠、乙酸钠、苯丙氨酸可有效促进紫杉醇的生成产量，产量最高可达242.6 g/L[68]。

近年来，随着生物化学、分子生物学等学科的不断发展，G. fujikuroi产GAs的合成途径已逐渐清晰，合成途径中的大部分关键酶基因的功能也都研究得较为深入，但在代谢调控机制方面，前体物代谢调控方面研究不够深入，还有待于进一步探索。本课题组致力于G. fujikuroi中GA4的前体物代谢调控研究，发现前体物对GA4效价提高有显著影响。

目前GA的生产主要通过液态深层发酵来实现，但GA需求日益增长与工业生产的高成本形成了尖锐的矛盾。因此，一方面可利用代谢工程对GA合成途径进行分子改造，获得GA种类单一、稳产高产的工程菌株；另一方面可通过宏观代谢调控发酵工艺优化方式提高GA产量，具体体现在以下3个方面：1)转移或构建新的细胞代谢流。通过对基因和基因簇的克隆、定点敲除、同源重组、定向诱变等方式构建新的细胞代谢流，提高GA积累水平。目前，用于GA生产的菌主要是G. fujikuroi和串珠镰刀菌。随着研究的不断深入，发现甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus[69]、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens[70]、草螺菌Herbaspirillum seropedicae[71]等细菌也能产生GA，但目前能够应用于工业生产的细菌还未见报道。而且除GA外，其他萜类化合物如β-胡萝卜素、青蒿素等均在构建工程菌株展开了深入研究。因此，可以借鉴其他萜类化合物的研究思路作为后续深入探究提升GA产量的新方向。2)增加GA合成代谢流。一方面可以通过改造和调控微生物内源代谢途径，提高限速酶的表达量。另一方面可以直接在发酵过程中添加前体物，王卫等[69]在培养基中添加L-异亮氨酸、草酰乙酸、MVA等合成前期的小分子物质，较添加单一前体MVA，GA3产量提高了11.6%。目前通过该方面进行调控GA产量的研究相对较少可进行深入探究。3)发酵工艺优化。首先可以通过分析G. fujikuroi中GA代谢调控机制，微观为思路，宏观为导向，对菌株最适生长条件进行优化；其次创新开发新型的发酵方式，满足GA的商业需求。