图1 新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查推荐流程

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二、筛查及诊断实验室设置要求

临床实验室应符合《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》的相关要求，以规范实验室管理，保障检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性[6,7,8]。此外，作为筛查及诊断实验室还应达到以下要求。

（一）G6PDd筛查实验室设置要求

新生儿G6PDd筛查实验室所在医疗机构资质、技术人员资质以及实验室的设置应符合《新生儿疾病筛查技术规范（2010）》的要求[9]。

（二）G6PDd诊断实验室设置要求

新生儿G6PDd诊断实验室在实验室人员设置、工作区域及仪器配置、数据解读、质量控制等方面应遵从《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的相关规定[10]。

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三、新生儿G6PDd筛查

（一）筛查方法选择

G6PDd筛查通用技术包括高铁血红蛋白还原试验、硝基四氮唑蓝纸片试验、G6PD缺陷变性珠蛋白小体试验、荧光定量分析法。其中荧光定量分析法通量和自动化程度高，具有较高的特异度与灵敏度，被大多新生儿筛查实验室采用，是目前新生儿G6PDd筛查的推荐方法。

（二）荧光定量分析法检测原理及流程

检测原理：干血滤纸片样本G6PD作用于底物葡萄糖-6-磷酸及氧化型辅酶Ⅱ，将葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖酸，同时将氧化型辅酶Ⅱ还原为还原型辅酶Ⅱ，在特定激发波长（355 nm）和发射波长（460 nm）下检测还原型辅酶Ⅱ的荧光强度，可定量检测G6PD活性。

检测流程：按照商品化试剂盒说明书完成。

（三）检测程序的验证

筛查实验室应当对采用的检测系统的性能进行评估。评估结果与操作说明书一致，则认为其通过"验证"，才可以用于临床服务。

性能验证时需包含精密度、准确度、线性范围等评价指标；其中批内不精密度和批间不精密度应分别小于最大允许误差（30%）的1/4和1/3[11]；评价准确度时符合标准的检测值通过率应≥80%，达到国家卫健委临检中心室间质评的基本要求；线性范围评价时，对线性回归方程Y=aX+b及相关系数R2的要求为，R2≥0.95，a在0.97~1.03范围内。评价方法参见CLSI关于精密度（EP15-A，EP5-A）、准确度（EP9-A2）、线性范围（EP6-P）、干扰实验（EP7-P）等的评价指南[11]。

经过验证的检验程序或仪器，其标准操作规程发生变化、仪器被重新组装、发生严重检测失败事件采取重大纠正措施后，检验程序需要重新完成方法验证且结果达到要求、经实验室质量负责人确认后方能再次使用。

（四）结果判读

1．阳性切值的设置：

各实验室应参照试剂盒说明书及本实验室数据制定本地化的阳性切值，具体方法建议参考CLSI《关于临床实验室如何确定和建立生物参考区间的标准与指南》（CLSI-C28-A2：2000）[12]。

2．推荐荧光定量分析法阳性切值：

2.1~2.6 U/gHb；针对男、女新生儿设置不同切值有助于女性杂合子的检出；当检测结果大于切值（2.1~2.6 U/gHb）时，判读为正常；当检测结果小于切值（2.1~2.6U/gHb）时，判读为异常；当检测结果等于切值或位于切值附近，应注意排除女性杂合携带者[13]。

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四、G6PD缺乏症诊断

（一）G6PDd鉴别诊断技术及推荐流程

G6PDd新生儿疾病筛查阳性时，酶学水平的确诊采用G6PD/6GPD比值法；基因诊断建议采用多色熔解曲线分析法（multicolor melting curve analysis，MMCA）或DNA直接测序分析[14,15]。G6PDd鉴别诊断推荐流程见图2。

图2 新生儿G6PDd鉴别诊断推荐流程

（二）G6PD/6GPD比值法诊断

1．检测原理及流程：

分别测定红细胞中G6PD与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconatedehydrogenase，6PGD）的活性；一定比例的硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）和葡萄糖6-磷酸盐（glucose 6-phosphate，G6P）混合液用于测定G6PD活性；一定比例的NBT、PMS和6-磷酸葡萄糖酸混合液用于测定6PGD活性；两个反应分别在不同的试管内进行。反应原理均为催化其相应的底物反应，同时将NADP还原为NADPH，通过在650 nm处吸光度上升的速率，可计算两者活性，再计算两者比值，可判断G6PD是否缺乏，提高女性杂合子检出率。检测流程参照商品化试剂盒说明书进行。

2．结果判读：

男性G6PDd患者和纯合子女性G6PDd患者在G6PD活性轻度降低甚至在正常下限的情况下，通过计算G6PD/6PGD的比值可以检出；但女性杂合子G6PD/6PGD的比值变化范围较大，在新生儿期G6PD/6GPD比值结果小于等于1.0时，结果可判断为异常；G6PD/6GPD比值结果在大于1.0小于等于1.3时判断为可疑，建议结合基因诊断结果进行综合判断；G6PD/6GPD比值结果大于1.3时为正常[1,5]。

3．质量控制：

（1）检验前：需要对样本是否溶血、凝血以及保存条件等质控指标进行监控。（2）检验中每次试验以已确诊标本作为阳性对照，以正常标本作为阴性对照，监控本批试剂的可靠性，并对仪器的状态进行监控。定期与开展本项目的实验室进行室间比对，以评估本实验室的检验能力。（3）检验后：监控报告发放时间及报告不合格率；定期评估报告与临床或基因诊断结果的符合度。

（三）G6PDd基因诊断

1．G6PDd推荐诊断方法：

G6PD基因突变以单个碱基置换的错义突变为主。已报道的中国人群突变类型有40余种，其中c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.1024 C>T五种突变类型占约95%；c.392 G>T、c.487G>A、c.517 T>C、c.592C>T、c.1004 C>A五种突变类型占约3.5%；其他类型偶发[14,16]。G6PD基因突变具有显著的地域差异，建议不同实验室根据本地区患者G6PD基因突变频率及实验室技术条件选择合适的基因诊断方法，见表1。

表1 新生儿G6PDd推荐诊断方法

2．测序报告解读：

Sanger测序是DNA序列分析的金标准，但其准确率尚无法达到100%，部分碱基无法被Sanger测序所识别；基于高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）技术的临床应用，应遵循国家卫生健康委医政医管局印发的《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》[18]；NGS测序报告应由实验室专业技术人员、临床医学和生物信息学不同背景的人员共同完成；序列变异的解释建议参考美国医学遗传学与基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）和美国分子病理协会（Association for MolecularPathology，AMP）发布的临床NGS测序标准及致病性评定标准[19,20,21]；测序报告应明确标注检测方法、适用范围及局限性。

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五、质量控制

筛查实验室应建立适当的室内质控规则，以监控系统误差和随机误差：选择合适的质控品，做好质控记录，定期进行质控分析，失控时提出纠正措施并进行持续跟踪和监控。筛查实验室应参加由国家卫生健康委临床检验中心组织的室间质量评价活动，利用实验室室间比对，来评价本实验室检验能力[22]。针对新生儿G6PDd筛查、诊断等不同环节加强相应的质量控制[23]。不同方法的质量控制要点见表2。

表2 新生儿G6PDd筛查实验室检测技术质量控制

本共识旨在为G6PDd的新生儿筛查提供实验室技术及诊断方法参考，规范G6PDd筛查、诊断等检测技术管理流程，督促各实验室提供标准化的筛查服务，以进一步提高新生儿G6PDd筛查的覆盖率，预防和降低新生儿期黄疸，特别是核黄疸的发生率。

（余朝文、张娟、万科星执笔）

参加本共识制定的单位及人员（按单位首字母顺序）：北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心/北京市临床检验工程技术中心（王治国、何法霖、王薇）；重庆医科大学附属儿童医院（邹琳、余朝文、张娟、万科星）；福建省新生儿疾病筛查中心（朱文斌）；广东省梅州市新生儿疾病筛查中心（黄烁丹）；广东省妇幼保健院广东省新生儿遗传代谢病筛查中心（江剑辉）；广西壮族自治区妇幼保健院（范歆）；贵州省疾病预防控制中心妇幼保健所（张宏红）；海南省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心（王洁）；湖北省妇幼保健院医学检验科（王维鹏）；湖南省妇幼保健院（唐华）；江苏省徐州市妇幼保健院（顾茂胜）；山东省青岛市妇女儿童医院（李文杰）；山东省青岛大学附属医院（刘世国）；山东省妇幼保健院（周玉侠）；陕西省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心（强荣）；上海市儿童医院新生儿疾病筛查中心（田国力）；上海交通大学医学院附属新华医院（韩连书）；四川省妇幼保健院新生儿疾病筛查中心（欧明才）；云南省妇幼保健院（顾菀茜）；浙江大学医学院附属儿童医院（曲一平、尚世强、杨茹莱、黄新文）；浙江宁波市妇女儿童医院（陈意振）；郑州大学第三附属医院（河南省妇幼保健院）新生儿疾病筛查中心（赵德华）。

选自中华检验医学杂志2019,42(3)

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图片来源：pixabay,版权归原作者所有返回搜狐，查看更多