钟珉 覃鸿毅 柴喜荣 杨暹 康云艳

摘要 普通分子生物学实验具有实践性和操作性强等特点，病毒诱导基因沉默技术（VIGS）是操作简单、实践性和操作性强的前沿生物学技术。本研究在菜心VIGS沉默植株构建的教学实验中，以种子真空侵染方法为基础，通过优化侵染浓度、侵染时间和共培养时间，得到了操作简单，侵染效率和植株成活率高，白化表型明显的侵染体系。通过实验教学可知，菌液OD600为0.80，侵染时间5 min，培养15 h的侵染效率最高，BcPDS基因的表达受到抑制，侵染优化后的菜心VIGS体系稳定且高效。该教学实验的构建使学生的学习兴趣得到了明显提高，培养了学生创新思维能力和独立工作能力，锻炼了学生的动手能力，并具备一定的创新和科研能力。

关键词 菜心；病毒诱导的基因沉默；技术改良；实验教学；创新能力

中图分类号 S63；G642.0   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2024）10-0102-05

病毒诱导基因沉默技术（VIGS）使病毒携带目的互补脱氧核糖核酸（cDNA），然后用其侵染植物，与植物自身RNA配对成为杂合双链RNA（Double strand RNA，dsRNA），错误的dsRNA被切割形成小干扰RNA，再经过一系列过程形成RNA诱导的沉默复合体，最终降解靶基因RNA序列，沉默目的基因[1]。早期研究多围绕本氏烟草、番茄等作物的RNA病毒进行研究，以烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）作为侵染载体，使其携带目标基因八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）cDNA反义链，烟草叶片被侵染后出现光漂白现象。此后，科研人员根据植物病毒特性开发出越来越多的新病毒，诱导得到基因沉默载体，在诸多植物基因功能研究中发挥着重要作用[2-3]。此外，植物类胡萝卜素合成中的关键酶PDS表达受到抑制易导致植物光保护作用缺失，出现光漂白现象，叶片白化，表型与对照有明显差异。基于此，常选择PDS沉默作为参照，研究侵染效率。因此，VIGS是基于植物对RNA病毒的防御机制，可抑制目标基因表达，用以表征植物基因功能的转录技术[4-6]。由于VIGS技术具有容易操作、周期短、低成本、不需要遗传转化和耗材成本低等优点，被广泛用于植物基因功能研究中[7-9]。与小白菜、拟南芥等其他十字花科作物相比，菜心的基因鉴定、功能分析等研究进展速度较慢。因此，快速构建菜心基因功能高效鉴定体系十分重要。对常规遗传转化进行基因功能验证须至F2或者F3代后才能开展，VIGS研究基因功能周期较短，侵染番茄或烟草后约20 d可观察到明显的白化表型。在菜心种子侵染VIGS体系中，14 d可观察到白化表型并进行功能验证。同时，由于菜心遗传转化体系不成熟，转化效率低，转化存在一定困难。

随着分子生物学技术的发展和研究生培养方案的调整，研究生选修课程高级蔬菜栽培学开设了相关实验课程，菜心VIGS沉默植株的构建是实验内容之一。菜心属于华南地区特色蔬菜，种子发芽后，采取传统的子叶注射法创制沉默植株，易出现注射手法不熟练或注射时间难以控制等问题，可能使子叶脱落，幼苗死亡，无法获得沉默植株[7-11]。

本研究在实验课程中引入农杆菌真空渗透法，优化侵染浓度、侵染时间和共培养时间等实验参数，形成规范的操作流程，整理成操作手册，改善实验操作结果，提高教学成果。目的在于调动学生参与具体实验的积极性，促使学生理解并掌握VIGS技术原理和方法，加深学生对理论知识的理解，提高其实验操作技能，为其利用VIGS技术开展基因功能验证奠定基础，培养和提升其科研能力和实践能力。通过完整的实验教学，让学生充分参与实验过程，提高操作技能，充分培养学生独立工作和创新思维能力。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为“油青四九”菜心植株发芽的种子。试剂配方主要包括大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、质粒提取试剂盒、DNA提取试剂盒、pTRV1质粒、pTRV2-BcPDS质粒、琼脂糖、卡那霉素、氨苄青霉素、利福平、农杆菌侵染缓冲液和LB培养基等。农杆菌侵染缓冲液成分为10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸（MES）、10 mmol/L氯化镁（MgCl2）和200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）。实验仪器有电子天平、摇床、移液枪、离心机、PCR仪器、培养箱和超净工作台等。

1.2 VIGS沉默植株教学方案构建

1.2.1 实验原理  VIGS利用攜带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性的诱导序列同源基因mRNA降解，从而引起植物内源基因沉默、表型或生理指标变化。

1.2.2 实验方法  （1）菜心植株总RNA和cDNA的提取。按照RNA提取试剂盒操作步骤提取总RNA。依据HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）试剂盒操作步骤进行反转录操作获得cDNA。提取菜心总RNA时，要严格按照操作手册进行，应注意于低温环境下迅速研磨，防止样品中RNA降解；选择种子活力较好的菜心种子；农杆菌OD600值为0.80左右；现配现用侵染缓冲液；及时更换注射器和手套，防止交叉污染。

（2）pTRV2-BcPDS载体构建及农杆菌转化。根据菜心BcPDS的全长cDNA序列，用引物设计软件设计特异性引物（F：GCAAAATACAGGTCATGTAT；R：CTATCTCCAGACAATGAAGAGA）。PCR扩增得到249 bp大小的PDS基因片段，将上述基因片段重组连接到pTRV2载体上，转入感受态细胞DH5α中，提取质粒。然后将测序正确的重组质粒（pTRV2-BcPDS）通过电击法转入农杆菌感受态GV3101细胞中。

（3）农杆菌侵染。取菜心种子50粒，用有效氯1%的次氯酸钠消毒液对种子消毒后，置于带有干净滤纸的培养皿中发芽；将得到的pTRV1和pTRV2单克隆培养液以1∶1比例混合，pTRV1与pTRV2-BcPDS单克隆培养液以1∶1比例混合，分别按照1∶100比例转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养农杆菌菌液，至OD600值在0.04～1.20范围内，并调整至两个三角瓶菌液OD600值相同。将等量的发芽菜心分别放入蓝口瓶中，在对照组中加入5 mL含pTRV1和pTRV2的转化菌液，处理组中加入5 mL含pTRV1和pTRV2-BcPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用真空泵对蓝口瓶抽真空，每次抽60 s，每次间隔2 min，操作3次；最后在28 ℃下暗培养24 h。观察侵染浓度对白化表型率和成活率的影响，确定最佳侵染浓度，观察侵染时间对白化表型率的影响，确定最佳侵染时间。培养结束后，移栽至土壤中继续生长14 d后观察表型，提取RNA，使用荧光定量方法检测沉默菜心中BcPDS基因的表达情况。具体技术路线如图1所示。

1.3 实验教学效果评价

从菜心育苗、PCR扩增、载体构建、酶切、质粒提取和转化、农杆菌制备和侵染等整个实验流程来评价实验教学效果，综合评价学生学习效果。

2 结果与分析

VIGS技术常被用于烟草、番茄、辣椒、玉米、矮牵牛和草莓等作物的基因功能验证。实践中，在菜心中采用常规方法进行基因功能验证易导致幼苗死亡、不稳定以及难以获得沉默植株等。本研究根据多年实验教学经验，采用真空渗透法进行VIGS沉默基因，对主要实验步骤进行优化。OD600指溶液在600 nm波长处的吸光值，吸光值正比于溶液中吸光物质的浓度，因此，本研究以OD600具体值表征菌液侵染浓度。

2.1 侵染浓度对白化表型率和成活率的影响

合适的农杆菌侵染浓度是获得沉默植株的基础，农杆菌侵染浓度会影响侵染后菜心的白化表型率和存活率，浓度过高或过低都会直接影响侵染效果。因此，本实验选取OD600值0.05～1.60作为侵染浓度变化范围进行筛选。结果表明，OD600为0.40或0.80时，菜心植株存活率差异无统计学意义（P>0.05）；OD600为0.80时，侵染后菜心植株的白化表型率高于OD600浓度为0.40时的侵染结果；OD600为0.80或1.20时，植株白化表型率在0.60%左右，OD600达到1.60时，侵染后的植株存活率明显降低（图2）。因此，菌液OD600 为0.80时为最佳的侵染浓度。

2.2 侵染时间对白化表型率的影响

为确定侵染时间对转化效率的影响，分析OD600为0.80条件下，不同侵染时间对白化表型率的影响。由实验可知，当侵染5 min时白化表型率最高，为0.57%（图3）。因此，最佳侵染时间为5 min。

2.3 共培养时间对白化表型率和存活率的影响

在OD600为0.80，侵染5 min时，将共培养时间分别设置为0、5、10、15、20和25 h。分析发现，白化表型率随着共培养时间增加呈降低的整体趋势，共培养15 h时存活率最高，达到0.32%（图4）。

2.4 侵染对BcPDS基因表达量的影响分析

在染菌种为GV3101，侵染菌液OD600为0.80，侵染5 min，共培养15 h的条件下，提取样品RNA进行实时定量PCR检测。检测发现，与侵染后培养0 d相比，培养7 d后叶和根中的BcPDS基因表达量大幅下降（图5）。

2.5 表型观察

侵染后培养约8 d，侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株上位叶片出现光漂白现象。白化首先出现在新叶处，呈现白色斑点状，然后从新叶向老叶扩散，部分叶片和植株14 d后几乎完全白化。侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株15 d后叶片大面积白化，但侵染TRV：00的菜心植株没有出现明显变化（图6），表明BcPDS基因的表达受到抑制，被成功沉默，实验体系成熟高效。

2.6 实验教学效果分析

相较于其他实验，VIGS实验全流程具有明显的探究性、设计性和综合性的特征，具有连续性和系统性，是一个完整的实验和科研过程。在教学过程中，学生能够积极主动地参与到实验的各个步骤中，从菜心育苗直至侵染等环节，学生成为实验的主导者，能够认真主动地完成各个实验。此外，VIGS实验各个步骤之间紧密相扣，相辅相成，前面的实验成功与否直接影响后续实验的成败，能够帮助学生构建完整的实验体系。另外，当发现沉默植株出现白化现象，学生会感到非常自豪、激动和兴奋，更加觉得实验有趣、科学和神奇，这种完成实验的成就感较强，充分调动了学生的学习积极性和兴趣。总的来说，学生可从该实验中得到了多方面的锻炼，视野和思路得到了扩展，理论知识也得到了进一步丰富。

2.7 实验注意事项

提取菜心RNA时要低温快速操作，防止RNA降解；挑选菜心幼苗要注意在合适的苗龄（10～15 d的幼苗）注射农杆菌悬浮液；调节农杆菌悬浮液到合适的浓度，不易过高或过低；侵染缓冲液要现配现用，4 ℃保存，增加農杆菌的渗透性；要避免交叉污染，及时更换注射器和一次性手套等实验耗材。

3 结论与讨论

VIGS技术具有简单高效等优点，十分适用于基因功能研究。近年来，研究人员利用BSMV载体进行小白菜基因沉默，建立了高效沉默玉米基因的VIGS体系等，为单子叶、双子叶等植物基因功能研究提供了高效且多样化的途径。TRV病毒株系具有感染症状轻且沉默效率高等优点，是目前应用较为广泛的VIGS载体。部分生物学课程在实验教学中开展了少量的VIGS实验[11]，而VIGS实验在园艺方向上的研究生培养及实验教学中有待进一步增加。因此，本研究利用菜心种子，以TRV为载体，从VIGS侵染因素入手，构建易操作的菜心种子VIGS体系，对遗传转化难、转化时间久的菜心进行基因功能研究，对菜心种子VIGS体系的相关参数进行优化。实验表明，菌液OD600为0.80，侵染5 min，共培养15 h时侵染效率最高，BcPDS基因的表达受到抑制，侵染优化后的菜心VIGS体系稳定且高效。利用该体系能够对菜心候选基因功能进行快速初步验证，为基因功能分析和菜心育种奠定基础，也能让学生进一步掌握基础分子生物学实验操作，加深其对利用分子生物学实验技术解决生物学问题的理解。

将该实验引入实验教学中，能帮助刚进入研究生阶段深造的学生理解和掌握分子生物学的一些基本原理、分子实验操作流程和操作注意事项。新方法可以帮助学生更好地理解PCR扩增、载体构建、酶切、质粒提取和转化、农杆菌制备和侵染等一系列基础分子实验。此外，VIGS实验与其他传统小实验相比，具有较高的探究性、设计性和综合性，是一个连续、系统的操作过程，能够锻炼学生综合素质，拓宽其学习思路。

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（责编：张 蓓）

安徽农学通报2024年10期