目的基因的获取

2023-07-09 02:47| 来源: 网络整理| 查看: 265

目的基因的获取 2010-03-21 16:00 · Thera

基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。目前目的基因的获取方法主要有以下2类：（1）已知基因的获得：

基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。

目前目的基因的获取方法主要有以下2类：

（1）已知基因的获得：PCR分离法和化学合成法等

（2）未知基因的获得：直接分离法和基因文库分离法等

第一节直接分离法

1、限制性内切酶法

用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。

应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少，获得也比较简单。

（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。

（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。

（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。

2. 随机片断化

2.1. 限制性内切酶局部消化法

控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。

2.2 机械切割法

（1）超声波

超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。

（2）高速搅拌

1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。

3. 物理化学法

基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。

3.1密度梯度离心法

由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪瞻5SDNA和海胆组蛋白基因就是根据此分离得到。

3.2单链酶解法

DNA分子中某基因片段GC碱基含量高，则其热稳定性高，即其解链温度（Tm）值就高。据此，可以通过控制解链温度使富A=T区变性解链，而富G≡C区的DNA的片段。海胆rDNA分子内GC含量可高达63%，通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA。

3.3 分子杂交法

单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这是分子杂交的原理。1969年，美国哈佛大学Beckwith等应用DNA-DNA分子杂交，成功分离了b-半乳糖苷酶基因。

第二节 PCR分离法

如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。摸板可以是基因组DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。

与直接分离获得目的基因相比，采用PCR分离目的基因省时、省力，但他一般要求待扩增的片段是已知的，至少要求DNA片段两端长约20bp的序列已知的，这样才能设计出有效的引物。但利用常规的PCR合成的片段一般在1kb以内。

PCR反应过程：

①变性。这是PCR反应的第一步，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；

②退火。将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；

③延伸。将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。

如果大量扩增未知序列的特异DNA片段，或是更长的DNA片段，则需选择特殊类型的PCR策略。如套式PCR、反向PCR、不对称PCR、锚定PCR等。

第三节构建基因文库分离法

（一）基因文库

1. 概念

基因文库（gene library）是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA 片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）（或成活细胞）即为一个DNA 片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。

2、意义

（1）使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来

（2）是分离克隆目的基因的主要途径

（3）复杂基因组作图的重要依据。

3、构建

基因文库构建的一般步骤：（1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体与外源大片段连接；（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；（5）重组DNA的筛选和鉴定。构建过程如下：

图1 基因组文库构建的概况

举例：

图2 采用λ噬菌体载体EMBL3A产生基因组DNA文库。高相对分子质量的基因组DNA由Sau3A I部分地消化。得到的片段用磷酸酶处理，以去除它们5’端的磷酸基团。载体由BamH I和EcoR I消化，它们在多位点接头内切割。微小的BamH I／EcoR I多位点接头的片段在异丙醇沉淀中除去，或者还可以通过预先的琼脂糖凝胶电泳纯化载体的臂。接着载体臂和经过部分消化的基因组DNA相连接。磷酸酶的处理可以防止基因组DNA片段自相连接。非重组载体不能重新复原，因为那些小小的多位点接头片段已去除。仅有的装配分子则是重组噬菌体。它们是作为Sup+大肠杆菌的P2溶源菌的噬菌斑获得的。Spi-筛选确保了缺乏red和gam基因的噬菌体的复原。Sup+宿主是必要的，因为在这个例子中，载体在基因A和B上带有琥珀突变。这种突变增加了生物保守性，可以用于筛选的程序(比如重组筛选)，或Sup+基因的DNA标记。最终，外源的DNA通过SalI位点从载体上切除[注意：Roger：等(1988)已经发现EMBL3多克隆为单序列并非完全像以前描述的那样。它包括一段特别的序列，上面有一个以前没有报告过的Pst I位点。但这不会影响到载体的大多数功能。

4、基因组文库的大小

一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。

N：克隆数目

P：设定的概率值（如：0．99）

x：插入片段平均大小（15～20kb）

y：植物基因组大小（以kb计）

如果插入片段平均大小为 20 kb 某植物基因组大小为 4 x 106bp，P=0.99时，根据上式 N≈1 ×105。

含 1×105个克隆的基因文库相当覆盖了 5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。

（二）cDNA文库

1、概念

cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增。

2、cDNA文库的特点

（1）不含内含子序列。

（2）可以在细菌中直接表达。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比DNA文库小的多，容易构建。

3、构建

cDNA文库构建共分四步：

①细胞总RNA提取并分离纯化出mRNA；

②合成cDNA第一链；

③将mRNA－DNA杂交分子转变成双链cDNA；

④双链cDNA重组到载体上。

前3步为cDNA合成，第④步为cDNA克隆。

举例：

定向cDNA克隆的方法。(a)早期的策略，其中环的形成是用来在双链cDNA的开放末端放置一个特异性接头(在此例中为Sal I的)的。连接之后，环经切割并用S1核酸酶处理，再将EcoR I接头加到两个末端上。用EcoR I和Sal I裂解可以产生一个限制性片段，该片段可以单向插入到经同样的酶切割后的载体中去。（b）一个近似的策略，但是第二条cDNA链的合成是随机引导的。用寡聚T引物延伸形成一个Sal I位点。在第二条链的合成中，这就形成一个双链化的Sal I接头。再向两个末端都加入另外的EcoR I接头，就使cDNA可以像上面所说的那样进行单向克隆。(c)Okayama和Berg的策略(1982)，其中mRNA在cDNA合成之前就在cDNA尾巴辅助下单向连接到质粒克隆载体上

4、cDNA文库的大小

一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。

p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）

1/n: 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例

N：所需的重组载体数（克隆数）

(三)基因组文库与cDNA文库的区别

1. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在：

（1）cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。

（2）cDNA基因文库的筛选比较简单易行。

（3）由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。

（4）cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。

原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。

（5）cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究

种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定

2. cDNA文库与基因组文库相比的缺点

（1）受材料来源的影响：

（2）遗传信息量有限：

①文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该植物在某一特定发育时期，某一特定组织（或器官）在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该植物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。

②cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。

（3）构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少

(四)克隆的鉴定方法

要鉴定DNA文库中的一个特殊克隆，可以通过克隆的序列和其表达产物的结构功能来进行的。前者可用于任何类型的文库、基因组或cDNA，它包括核酸杂交和PCR。无论哪种情况，探针或引物的设计都可用于一个特殊的克隆或者一系列结构相关的克隆。注意，PCR筛选也可用于从未克隆的基因组DNA和cDNA中分离DNA序列。对克隆产物的筛选仅用于表达文库，例如DNA片段可用于表达一个蛋白质的文库。在此情况下，克隆可得到鉴定，因为其产物可由一些自然的抗体或配基来确定，或者因为保持了蛋白质的生物活性，而可由适当的检验系统来检测。

筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。

探针是由目的基因的已知的信息决定的，有三种可能性：

1）目的基因在特定细胞中的丰度

2）基因所编码的蛋白质或者部分序列

3）基因是一个基因家族中的一个

举例：利用同源探针筛选目的克隆

任意的两条单链核酸分子都有可能通过碱基配对结合，大部分的配对分子是不稳定的，因为只有少量的碱基配对。然而如果两条链是互补的，大部分碱基可以配对形成稳定的分子。不仅DNA间可以配对，DNA 与RNA间也可以进行配对。因此可以使用同源探针筛选目的克隆。

如果克隆的基因所编码的蛋白已知。就可以利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码，其他的氨基酸至少有两种密码子。例如丙氨酸有四种密码子，前两位是相同的，GCA,GCT,GCC,GCG，只能正确的预测两位的碱基。

例如细胞色素C，从59号氨基酸的一段序列：Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met，相应的DNA序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG，在18个碱基中有14个是可以预测的。如果用来杂交的18核苷酸的序列有上千种可能的排列，很显然不适合于合成探针。

利用同源探针克隆基因

第四节化学合成

1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。其中，全自动合成仪化学合成DNA采用效率极高的是固相亚磷酸三酯法。

固相亚磷酸三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA的合成，其合成方向是由引物的3′末端向5′端合成，相邻核苷酸通过3′—5′端磷酸二酯键连接。其过程为：（1）将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；（2）合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体（其3′端被活化，5′-羟基的仍然被DMT保护），与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；（3）带帽反应，缩合反应中可能极少数5′-羟基没有参加反应，带帽反应中使用乙酸酐和1-甲基咪唑使这些核苷5′-羟基反应形成酰，终止其继续发生反应而成为短片段，这种短片段在纯化时分离掉；（3）缩合后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。