莫能菌素(monensin, MON) 是一种聚醚离子载体类抗生素[1-2]，拥有卓越的抗球虫效果，具有抗虫谱广、作用方式独特、耐药性形成缓慢等特点，是畜禽球虫病防治中最重要的防治药物，其销量占现今抗球虫药市场的80%[3]，也是肉鸡球虫病防控实践中应用最广泛的抗球虫药物。此外，莫能菌素还可以显著改善反刍动物营养物质利用率，提高能量水平，被广泛用作促生长饲料添加剂[4]。然而，莫能菌素被动物摄食后，吸收、代谢差，80%左右的药物以原药的形式随畜禽粪便排出体外，造成严重的环境污染[1]。由于莫能菌素水溶性较差、化学性质比较稳定，在环境中可长期存在[5]。大量研究表明，家禽饲养场所周围的土壤和水体以及相关的垫料中都存在大量的莫能菌素污染[6-9]；在无人为干预的情况下，农场家禽垫料中的聚醚类抗生素(包括莫能菌素) 可残留3年以上，其中莫能菌素3年后的残留浓度甚至高达(97.8±3.2) μg/kg[10]。此外，环境中残留的莫能菌素对土壤生物、水生生物、哺乳动物和人都会产生比较严重的毒害作用[11-13]，对人类的健康构成威胁。因此，莫能菌素污染环境的修复是一个亟待解决的问题。

环境中污染的抗生素类药物可以通过非生物降解和生物降解进行处理和修复。常见的非生物降解途径主要包括光化学降解和水解等。莫能菌素由于缺少与环境相关的吸收波长，因此很难进行光化学降解，但其在酸性环境下容易水解[4]。然而，用酸降解莫能菌素存在二次污染等缺点[5]，难以大规模推广应用。生物降解是聚醚类抗生素在环境中最重要的降解途径之一[14]。自然环境中存在大量可以降解聚醚类抗生素的微生物，这些微生物能将结构复杂的聚醚类抗生素降解转化为自身生长繁殖过程中所需的化合物或者无害的小分子化合物[14]。此外，生物降解还具有生态兼容性好、成本低、使用方便、无二次污染等优点，对莫能菌素等聚醚类抗生素引起的环境污染修复更有实际应用价值[15]。生物降解法修复抗生素污染环境的关键是筛选分离高效的降解菌株，然而，关于莫能菌素高效降解菌株的研究相对较少。目前，国内外仅有一株莫能菌素降解菌于1990年被从土壤中分离出来，鉴定为日食古菌(Sebekia benihana) 菌株[16]。因此，本研究以莫能菌素为靶标物，从莫能菌素污染的鸡粪中筛选出一株能够高效降解莫能菌素的菌株，并对其降解性能进行了系统研究，以期为莫能菌素污染环境的生物修复提供可靠的微生物材料和理论支持。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.0。基础无机盐液体培养基(mineral salt medium, MSM)：(NH4)2SO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.5。唯一碳源培养基：向锥形瓶中加入1 mL不同浓度莫能菌素丙酮溶液(0.22 μm有机滤器过滤除菌)，待丙酮充分挥发后，加入MSM液体培养基，充分混匀后备用。

所有培养基按上述配方和方法配制，之后分装于500 mL锥形瓶，在121 ℃下高压灭菌30 min。LB固体培养基和MSM固体培养基按液体培养基的配方配制，高压灭菌前加1.5% (W/V) 琼脂，灭菌后取出，倒入90 mm一次性无菌培养皿中，培养基凝固后倒置平板备用。

纯度为97.7%的莫能菌素钠标准品(Dr. Ehrenstorfer公司)；纯度为91.2%的莫能菌素钠原料药(山东齐鲁制药有限公司)；细菌微量生化鉴定管(北京陆桥生物技术有限责任公司)；色谱级甲醇和乙腈(默克公司)；分析级丙酮、吐温20、(NH4)2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、氯化钠、浓硫酸和香草醛(国药集团化学试剂有限公司)。

Waters e2695分离系统、2489紫外检测器和柱后衍生系统(沃特世股份有限公司)；DGG-9429型电热鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；摇床(北方同正生物技术发展有限公司)；UV-5200型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；ME204分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；生化培养箱(宁波江南仪器制造厂)；pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；OLYMPUS光学显微镜(奥林巴斯有限公司)。

称取莫能菌素污染鸡粪样品5 g置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL含20 mg/L莫能菌素为唯一碳源的MSM液体培养基中，于30 ℃、150 r/min振荡培养7 d，之后取4 mL培养液转接至100 mL含40 mg/L莫能菌素的MSM液体培养基中，再按上述培养条件培养7 d，按照上述步骤再连续转接培养2次，并逐次提高培养基中莫能菌素的浓度至80 mg/L和160 mg/L。完成4次富集驯化后，取最后一次160 mg/L莫能菌素驯化培养的菌悬液进行梯度稀释，并分别转接涂布至含40 mg/L莫能菌素的MSM固体培养基上，于30 ℃培养48 h，然后挑取形状、大小和颜色不同的单菌落，划线转接于含40 mg/L莫能菌素的LB固体培养基上，30 ℃培养48 h后再分别挑选出菌落形态规则、生长速度较快的菌株，进行传代、涂布，直至LB培养基上的菌落形态完全一致为止。最后将纯化后的菌株进行编号，用20%甘油冻存于–80 ℃，备用。

菌体形态学观察、生理生化试验及生长特性测定参照Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology进行。

采用细菌基因组DNA Mini试剂盒(Sangon, 上海) 提取莫能菌素降解菌DM-1基因组DNA。降解菌16S rRNA基因PCR扩增采用通用引物27F (5ʹ-AGAGTTTGATCMTGGCTCA G-3ʹ) 和1492R (5ʹ-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ)。PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序，得到的降解菌16S rRNA基因序列，上传至GenBank，编号为MH447170。使用BLAST搜索功能将测序结果与NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，采用MEGA 5.0软件，neighbor-joining法进行多序列比对分析并构建系统发育树。

将冻存备用的莫能菌素高效降解菌株DM-1，转接至5 mL无菌LB液体培养基中，30 ℃、150 r/min过夜复苏，之后取1 mL复苏菌液加入到99 mL无菌LB液体培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养至细菌对数生长期，然后，4 000 r/min离心10 min，取沉淀，用20 mL无菌无机盐液体培养基洗涤菌体2次，之后用10 mL无菌无机盐液体培养基重新涡旋菌体，制成菌悬液，并通过微调将菌悬液配制成OD600为1.5的预接种液。

将97 mL含有10 μg/mL莫能菌素的无机盐液体培养基置于摇床中振摇2 h (避光，30 ℃、150 r/min)，之后将3 mL上述预接种液加入实验组，对照组接入同体积无菌无机盐液体培养基作空白对照。避光30 ℃，150 r/min振荡培养28 d，分别在0、3、7、14、21、28 d取样。采用HPLC法(方法见1.2.8) 测定样品中莫能菌素的含量，计算各降解体系莫能菌素的浓度和降解率，同时监测降解菌OD600值的变化。试验重复3次。

式中，C0为0 d样品中莫能菌素的浓度；C为不同时间点样品中莫能菌素的浓度。

温度对降解菌生长及降解性能影响试验于100 mL含10 mg/L莫能菌素的无机盐液体培养基(含0.1%吐温20) 中进行。培养基pH为7.0，OD600为1.5的预接种菌液按3% (V/V) 比例添加，分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃恒温摇床中，避光振荡培养(150 r/min)，72 h后取样测定降解菌OD600值和莫能菌素的降解率。每个温度条件设置3个重复。

用酸碱pH标准校正液将无机盐液体培养基的初始pH分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，121 ℃，30 min高压灭菌后备用。pH对降解菌生长及降解性能影响试验于100 mL含10 mg/L莫能菌素的无机盐培养基(含0.1%吐温20) 中进行。OD600为1.5的预接种菌液按3% (V/V) 比例添加，30 ℃、150 r/min振荡培养72 h后，取样测定降解菌OD600值和莫能菌素的降解率。每个pH条件设置3个重复。

将OD600为1.5的预接种菌液按3% (V/V) 的比例接种于莫能菌素初始浓度分别5、10、25、50和100 mg/L无机盐液体培养基(含0.1%吐温20) 中，培养基pH为7.0，于30 ℃、150 r/min振荡培养72 h。每隔12 h取样一次，测定不同时间点莫能菌素的浓度。

色谱条件：Waters C18色谱柱(4.6 mm× 150 mm, 硅胶粒径5 μm)；Waters柱后衍生器；检测波长520 nm；柱温25 ℃；流动相配比，甲醇–水–冰乙酸(90︰10︰0.1，V/V)；流速0.7 mL/min；进样量20 μL；柱后衍生泵流速0.7 mL/min；衍生装置反应温度98 ℃；衍生试剂配比，香草醛︰甲醇︰硫酸=15 g︰ 475 mL︰10 mL。

标准储备液制备：精密称取纯度为97.7%的莫能菌素钠标准品1.02354 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入色谱级甲醇充分溶解并定容至刻度线，再次混匀，即得1 000 μg/mL莫能菌素钠标准储备液。储备液冻存于–20 ℃冰箱备用，用前恢复至室温。

标准工作液制备：精密吸取莫能菌素钠标准储备液，置于10 mL棕色容量瓶中，加入色谱级甲醇稀释至刻度线，倍比稀释配制系列浓度的标准工作液：100、50、20、10、5、1、0.1 μg/mL，储存于4 ℃冰箱备用，用前恢复至室温。

香草醛衍生液配制：量取20 mL浓硫酸，缓慢加入950 mL色谱级甲醇中，置于冰水浴中，缓慢加入30 g香草醛，混匀，脱气后避光保存，每次使用前现配。

莫能菌素标准曲线的绘制：将标准工作液取出，恢复至室温，用1 mL一次性注射器取适量，过0.22 μm有机滤膜于HPLC进样小瓶中，进行HPLC测定。以药物浓度(C) 为横坐标，HPLC检测的吸收峰面积(A) 为纵坐标绘制标准曲线。

MSM液体培养基中莫能菌素的提取净化：从–20 ℃冰箱取出冻存的无机盐样品，待其恢复室温后，吸取0.5 mL于15 mL离心管中，加入2 mL乙腈提取，振荡混匀1 min，超声10 min，然后10 000 r/min离心8 min，移取上清液，向沉淀物中再加入2 mL乙腈，重复提取1次，合并2次离心后的上清液于15 mL离心管中备用。用氮气吹干仪将上清液吹干，并迅速用甲醇定容至1.0 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤，HPLC上机检测。

使用SPSS软件进行数据的统计分析与计算，并使用ANOVA进行多重比较，Student’s t test检验差异显著性，GraphPad Prism 8.0画图。

经富集、分离纯化后得到1株能够高效降解莫能菌素的菌株，命名为DM-1。菌株DM-1在LB固体培养基上的菌落呈中等大小、圆形、灰白色、光滑的菌落形态(图 1A)。革兰氏染色结果如图 1B所示，由图可知该菌株为红色杆菌，革兰氏阴性菌。生理生化鉴定结果(表 1) 显示，葡萄糖、蔗糖和木糖阳性，硫化氢、硝酸盐还原、甘露醇、纤维二糖和麦芽糖均为阴性。

通过对莫能菌素降解菌DM-1的16S rRNA基因序列的比对分析发现，菌株DM-1与鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii) 和拜氏不动杆菌(Acinetobacter beijerinckii) 等多株不动杆菌一致性在95%以上，可以推测菌株DM-1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。为进一步确定菌株DM-1的系统发育地位，利用MEGA软件对包括DM-1在内的22株同源性较高的菌株构建系统发育树。由系统发育树的结果(图 2) 可知，菌株DM-1与Acinetobacter baumannii PS3位于同一分支，序列一致性高达99%。综合形态学、生理生化特征、16S rRNA序列和系统发育分析，可以确定菌株DM-1为鲍曼不动杆菌菌种(Acinetobacter baumannii)。因此，将其命名为Acinetobacter baumannii DM-1 (GenBank登录号：MH447170)。

本研究采用香草醛作为衍生试剂，对无机盐液体培养基中提取净化的莫能菌素衍生化后，用HPLC进行检测分析，图 3为莫能菌素的HPLC检测标准曲线，莫能菌素在0.1–100.0 μg/mL浓度范围内，HPLC检测峰面积与浓度线性关系良好，其线性回归方程为y=37 444 x–3 230，R2=0.999 993 (n=3)，满足药物残留检测要求。

对莫能菌素降解菌DM-1的降解能力及其生长情况进行研究，28 d内莫能菌素浓度变化和降解菌生长曲线如图 4所示，在以莫能菌素为唯一碳源培养的过程中，DM-1菌株生长迅速，OD600值维持在较高水平。此外，随着DM-1菌株OD600值的不断上升，莫能菌素浓度则不断下降。上述结果说明莫能菌素降解菌DM-1降解能力的强弱跟菌株生长性能呈正相关。此外，通过对莫能菌素的降解率进行分析发现，DM-1对莫能菌素28 d后的降解率达到87.51%，空白对照组28 d降解率仅为8.57%，该结果说明DM-1为莫能菌素的高效降解菌。

由图 5 A可知，随着温度的升高，72 h内莫能菌素的降解率增加明显，10 ℃时，莫能菌素的降解率仅为14.42%，20 ℃时为28.87%，30 ℃时，莫能菌素的降解率则高达64.75%。当温度高于30 ℃时，莫能菌素的降解率开始下降，40 ℃时莫能菌素的降解率为35.35%，当温度为50 ℃时莫能菌素的降解率更低，仅为8.47%，甚至低于10 ℃时的降解率，而且在10 ℃条件下DM-1的OD600值也高于50 ℃时的OD600值，该结果说明降解菌DM-1对低温耐受性更好，可以用于低温条件下莫能菌素污染环境的修复。此外，DM-1对莫能菌素的降解率及其OD600值均随着温度的升高呈先升后降的规律，这说明温度能显著影响降解菌DM-1的生长情况，并最终影响其对莫能菌素的降解能力。DM-1在温度为30 ℃的条件下，72 h后OD600值达到最高，为0.5左右，达到最大生物量，而此时莫能菌素降解率也最高，说明DM-1的最适生长和降解温度均为30 ℃。

不同pH对莫能菌素高效降解菌DM-1细胞生长及其降解能力的影响结果如图 5B所示，pH对莫能菌素降解菌DM-1的生长情况和降解性能有较大的影响，随着pH的增高，降解菌OD600值呈先升高后下降的趋势。莫能菌素的降解率也随着pH的变化，呈现先升高后降低的规律。上述结果说明降解菌DM-1的生长情况与莫能菌素降解率呈正相关。此外，pH值低于7时，DM-1的OD600值低于0.3，说明酸性环境能显著抑制降解菌的生长，进而影响降解菌对莫能菌素的降解。在pH值为7的条件下，DM-1菌株72 h后OD600值达到最高，为1.2左右，莫能菌素降解率也达到最大，说明DM-1菌株的最适降解pH为7。

为了考察不同初始浓度莫能菌素对高效降解菌株DM-1生长及降解能力的影响，本试验设计了5、10、25、50和100 mg/L五种浓度的莫能菌素降解体系。在无机盐培养基(pH 7，30 ℃、150 r/min) 中，经过72 h的培养，不同初始添加浓度对DM-1降解能力的影响见图 6。当莫能菌素初始浓度为5 mg/L时，经过72 h的降解作用，DM-1对以上5种浓度的降解速率分别为29.7、62.5、195.9、436.8和672.6 μg/(L·h)。DM-1对初始浓度为5、10、25、50和100 mg/L莫能菌素的总降解率分别为42.24%、41.87%、61.02%、65.37%和50.81%。上述结果说明，莫能菌素初始浓度对DM-1降解菌降解性能有显著影响，在一定范围内莫能菌素浓度升高有利于莫能菌素的降解，随着底物浓度的继续升高，超过微生物的耐受极限，菌株DM-1的降解效率开始受到抑制，降解率也随之下降，其中初始添加浓度为50 mg/L时菌株DM-1的降解率最高，达到65.37%，该浓度为菌株DM-1的最适莫能菌素初始添加浓度。

利用微生物降解菌株对环境中残留药物进行生物降解，从而修复受污染环境正成为环境修复领域的研究热点[17-21]。目前，聚醚类抗生素微生物降解的研究也已有一些报道。Vértesy等发现从土壤中分离到的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) 和成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans) 菌株可以将盐霉素分子分解成非离子产物[22]。Delort等从土壤中分离到的Sebekia benihana菌株可将尼日利亚菌素生物转化成3种代谢产物[23]。然而，有关莫能菌素降解菌的筛选及降解特性的报道很少。截至目前，国内外仅有一株莫能菌素降解菌于1990年被从土壤中分离出来，该菌株被鉴定为Sebekia benihana，但其降解性能并未见报道[16]。因此，筛选出对高毒性和长半衰期的莫能菌素具有较好降解能力的降解菌就显得尤为重要。

获得药物降解菌株的途径很多，常见的有定向培育、诱变育种和工程菌的改造构建等[24]，而在被兽药污染的鸡粪中可能会存在能够高效降解残留兽药的菌株，从中进行兽药高效降解菌株的筛选分离也是十分可行的方法。本研究通过富集驯化和唯一碳源法，从莫能菌素污染的鸡粪中筛选分离到一株新型莫能菌素降解菌株DM-1，该菌株对初始浓度为10 mg/L的莫能菌素，28 d后的降解率达到87.51%。通过形态学观察、生理生化特性分析和16S rRNA基因系统发育分析等，确定了高效降解菌DM-1为鲍曼不动杆菌菌株(Acinetobacter baumannii)，命名为鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii DM-1。相关的研究表明，鲍曼不动杆菌对化学污染物有很好的降解能力，孙大鹏研究发现，鲍曼不动杆菌菌株培养48 h对200 mg/L硝基苯的好氧降解率达60.53%[25]；阳重阳研究表明鲍曼不动杆菌菌株能高效降解偶氮染料，降解率可达90%以上[26]。本研究将拓宽该菌株在环境修复领域的应用范围。但需要注意的是，鲍曼不动杆菌属于条件致病菌，在环境中广泛存在，对医院ICU等特殊人群有一定致病性，减少其对医院等环境的污染是其危害防控的重点。因此，该菌株在实际应用前需要充分论证。但掌握和了解这类降解菌的降解性能，对推动抗生素类药物污染环境的生物修复依然意义重大。

通过对莫能菌素高效降解菌DM-1的降解特性进行研究，我们发现降解菌DM-1能够在较广的温度和pH范围内对莫能菌素进行有效降解，还可以耐受并降解高达100 mg/L的莫能菌素。莫能菌素高效降解菌DM-1的这些降解特性，对其在修复莫能菌素污染的畜禽粪便和有机废水实际处理应用中十分重要。本研究不但表明菌株DM-1在莫能菌素污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景，还将为抗生素污染环境的微生物修复提供理论支撑。尽管本研究对莫能菌素降解菌DM-1的降解效率及最适培养条件进行了研究，但是菌株DM-1对莫能菌素的生物降解途径和代谢产物尚不明确，在今后的研究中，通过改进代谢产物提取方法和优化检测系统，对其降解产物和降解途径进行解析，进一步探索其降解机理，将更好地促进其实际应用。