第十六章药物遗传毒性遗传毒性药物遗传毒性：由遗传毒物引起的细胞基因分子结构特异改变或使遗传信息发生改变的有害效应。DNA损伤，基因突变，染色体结构改变，染色体数目改变。第一节化学致突变作用突变(mutation)由环境因素突然改变所引起的生物遗传物质变化，最终导致生物遗传信息的改变。群体：遗传结构变化；个体：表型变化。是遗传物质的一种可遗传的变异。遗传结构：种群中占主导地位的交配方式和基因的遗传特性。种群中的基因多样性取决于基因突变、基因重组和外界种群的基因流入。自发突变(spontaneousmutation)由于自然界中环境因素的作用或由于偶然的复制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。自发突变(spontaneousmutation)的发生率很低，它提供了生物进化的基础。回复突变：致突变作用或诱变作用(mutagenesis)环境因素引起生物体发生突变的作用及过程称为致突变作用或诱变作用。环境中存在的可诱发突变发生的因素包括化学因素(各种化学物质)、物理因素(如电离辐射)和生物因素(如病毒)。在此特指由于人为因素导致的生物体生存环境剧烈变化的因素。化学诱变剂(chemicalmutagen)凡能引起致突变作用的化学物称为化学诱变剂(chemicalmutagen)。直接诱变剂(direct-actingmutagen)其原型或其化学水解产物就可以引起生物体突变的物质。间接诱变剂(indirect-actingmutagen)其本身不能引起突变，必须在生物体内经过代谢活化才呈现致突变作用的物质。基因突变一个或几个DNA碱基对的改变。

染色体畸变染色体的结构及数目改变。端粒姊妹染色单体着丝粒组蛋白双螺旋碱基对端粒腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶磷酸脱氧核糖主链DNAmRNAmRNA肽链氨基酸蛋白质的合成核苷酸三联体RNA氨基酸密码子表甘氨酸精氨酸精氨酸色氨酸半胱氨酸酪氨酸组氨酸酪氨酸脯氨酸谷氨酸苯丙氨酸异亮氨酸甲硫氨酸缬氨酸赖氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸丝氨酸丝氨酸谷氨酰胺天冬酰胺天冬氨酸A：腺嘌呤；U：尿嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶。A＝U，G≡C。

细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。细胞周期

G0：静止期；

G1：DNA合成前期；

S：DNA合成期；

G2：为有丝分裂做准备；

M：有丝分裂期有丝分裂的过程PREMETAPHAES中心粒核仁核核膜染色质丝间期染色质复制早前期染色体形成。中心粒移向两极。前中期中心粒染色体染色体纺锤丝染色体在赤道板排列中期中期中期后期末期间期中期后期中期后期有丝分裂减数分裂

突变的类型一、基因突变(genemutation)

1、点突变(base-pairsubstitution)某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。转换(transition)颠换(transvertion)2、移码突变(frameshiftmutation)发生一对或几对的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。二、染色体畸变(chromosomeaberration)染色体的结构改变染色体畸变裂隙(gap)

断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)

微小体(minutebody)无着丝点环环状染色体

双着丝点染色体

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重复(duplication)辐射体

染色体畸变

臂间倒位人类无着丝粒和双着丝粒染色体无着丝粒环染色体缺失环状染色体染色体插入染色体重复三、染色体数目畸变物种体细胞性细胞人4623大鼠4221小鼠4020猫3819兔4422狗7839不同物种动物的染色体1、非整倍体指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条称为单体(monosome)，增加一条称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2、整倍体指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中常有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。染色体数目异常：又称染色体数目畸变，也称基因组突变(genomicmutation)，主要指染色体的数目发生了改变标准:以动物正常染色体数目2n为基准整倍体单倍体三倍体四倍体非整倍体亚二倍体(2n-)超二倍体(2n+)

染色体数目异常的基本类型类型公式染色体组整倍体单倍体二倍体三倍体四倍体非整倍体单体三体四体双三体缺体n2n3n4n2n-12n+12n+22n+1+2n-2(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABC)(ABCD)(ABCD)(A)(ABCD)(ABCD)(AA)(ABCD)(ABCD)(AB)(ABC)(ABC)注：A.B.C.D.代表非同源染色体二.突变的不良后果同义突变:

是指没有改变基因产物氨基酸序列的改变，显然这与密码子的兼并性相关.错义突变:

是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变的致死突变:

发生在必需基因上，严重影响蛋白质的功能错义突变

渗漏突变:

突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与野生型之间中性突变:

突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改变不明显.突变对人类基因库的影响基因库：人群生殖细胞具有的能传给下一代的全部基因总和。遗传负荷：人群中个体新携带的有害基因平均水平。突变的不良后果突变

体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰亡配子死亡流产或死胎显性存活隐形存活遗传给子代一、致突变作用机制——DNA损伤或缺失导致遗传信息的改变1、碱基错配2、碱基类似物的取代3、碱基的化学结构改变或破坏4、嵌入DNA链5、DNA结构的损伤6、DNA的修复酶抑制7、有丝分裂的干扰致突变作用机制T:A5-BrU:A5-BrU:G碱基错配碱基类似物的取代碱基类似物在DNA复制时的掺入

BrUA:TG:CorG:CA:TA.TA.BrU掺入复制A.TG.BrU复制A.TG.CA.TA.BrU++A.TG.CG.BrUG.CA.BrU+G.CG.CA.BrU掺入复制复制+++APA:TG:CA.T掺入AP.T复制AP.TA.T+AP.TA.TA.TG.C++复制复制DNA损伤(一)DNA加合物和交联分子的形成

大加合物代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类后果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位

DNA的半保留复制和转录。小加合物代表物：烷化剂、亚硝基化合物后果：对DNA的构象影响较小，易导致碱基错误配对。DNA-DNA交联

DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接，称为DNA-DNA交联.如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气各种铂的衍生物(二)嵌合剂的致突变作用嵌合剂

原黄素丫啶橙染料分子插入一个碱基代表物：丫啶橙、原黄素等丫啶类染料分子方式：以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间后果：移码突变机体对突变的修复DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶二聚体光解酶错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复复制后修复呼救性修复嘌呤插入酶DNA连接酶DNA修复及修复抑制剂DNA损伤修复按其机制可分为损伤修复机制（repairmechanisms）损伤耐受机制（tolerancemechanisms）(一)损伤的逆转—O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase,AGT)或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)修复系统(二)碱基切除修复(baseexcisionrepair,BER)

由DNAN-糖基化酶启动

(三)核苷酸切除修复

(Nucleotideexcisionrepair,NER)

全基因组核苷酸切除修复转录偶联性核苷酸切除修复DNA修复合成（四）链断裂的修复

单链断裂的修复双链断裂的修复

单链退火(single-strandannealing,SSA)DNA非同源性末端连接(NHEJ)

重组修复(recombinationalrepair,RR)干扰有丝分裂秋水仙碱效应核内复制异常纺锤体形成染色体不浓缩染色体提前凝缩第二节药物致突变作用的评价一、遗传毒性实验的选择（一）遗传学终点及其类型1、遗传学终点(geneticendpoint)试验观察到的现象所反映的遗传物质的各种改变。如，基因突变、染色体畸变、染色体分离异常。⑴DNA完整性的改变；⑵DNA重排或交换；⑶DNA碱基序列改变（基因突变）；⑷染色体完整性改变（染色体畸变）；⑸染色体分离改变。

国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点：2、遗传学终点的类型（二）主要的遗传毒理学试验1、最常用的试验遗传终点遗传毒性实验基因突变试验鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)哺乳动物体内染色体损伤试验啮齿类骨髓染色体畸变试验或微核试验遗传终点遗传毒性实验基因突变试验大肠杆菌WP2色氨酸回复突变试验；培养哺乳动物细胞TK或HPRT正向突变试验；果蝇伴性隐性致死试验染色体畸变试验培养哺乳动物培养细胞染色体畸变试验微核试验啮齿类动物显性致死试验非整倍体试验DNA损伤检测方法培养肝细胞及啮齿类程序外DNA合成试验姐妹染色单体交换试验2、在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验二、遗传毒性实验的组合（一）原因遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。——单一的实验不能全面的检测各种遗传终点的变化，容易出现假阴性结果。①化学毒物的致突变机制不尽相同；②作用的靶部位不尽相同；③有直接致突变作用和间接致突变作用。应包括5类遗传学终点应包括多种进化程度不同的物种体内试验与体外试验配合体细胞试验阳性，再进行生殖细胞试验验证阳性结果在体内的真实性，必要时再选用生殖细胞致突变试验（二）组合原则

国际协调组织(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为：①细菌基因突变试验；②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；③体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。

我国《新药审批办法》中要求在新药临床前特殊毒理学评价中应包括致突变试验、生殖毒性试验（致畸试验）、致癌试验和药物依赖性试验。其中致突变试验的基本试验方法有三种：①鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）；②哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；③小鼠骨髓微核试验。上述三项致突变试验结果全部阴性时，则不必往下进行。三、常用的致突变试验鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株。(his-)正向突变回复突变±代谢活化系统S9受试物(一)Ames试验1、原理2、常用菌株⑴TA97，移码突变；⑵TA98，移码突变；⑶TA100，碱基置换；⑷TA101，碱基置换；微核(Micronucleus)是存在于细胞胞质中的染色体（断片、单体、整个染色体），染色与细胞核一致，体积比主核小，故称微核。其来源有二：①断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；②有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验的检测终点是DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。

(二)微核试验(Micronucleustest，MNT)MNNCE制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。（三）染色体畸变试验(chromosomeaberrationtest)观察裂隙、断裂、断片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、射体和染色体粉碎1、体外染色体畸变试验(invitrochromosomeaberrationtest)常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(CHL、V79)细胞及外周血淋巴细胞等。染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。染色体数目异常包括多倍体及非整倍体。2、体内染色体畸变试验(invivochrosomeaberrtiontest)主要有啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验(chromosomeaberrationofbonemarrowcells)和啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验(chromosomeaberrationtestoftesticlecells)。在啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验中，常用的有精原细胞及初级精母细胞染色体畸变试验。细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，在DNA合成期可与胸苷竞争掺入DNA中。经过一次有丝分裂后，仅在新合成的互补链中有5-BrdU的掺入；再经过一次有丝分裂，则一条单体中两条DNA链均有5-BrdU的掺入，而另一条则仅一条DNA链中有5-BrdU的掺入。由于5-BrdU对染料的亲合力下降，染色后会出现一深一浅两条姐妹染色单体。如果有交换发生就可在光镜下计数SCE，评价DNA的断裂和重接。(四)姐妹染色单体交换试验(sisterchromatid

exchageassay，SCE）(五)哺乳动物体细胞株突变试验常用的细胞株有中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠卵巢细胞株(CHO细胞株)以及小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。这些突变细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)或胸苷激酶(TK)，在DNA合成中不受碱基类似物的毒害。如果发生回复突变，则不能存活。正常细胞6-巯基嘌呤(MP)6-硫代鸟嘌呤(TG)8-氮杂鸟嘌呤(AG)5-溴脱氧尿苷(5-BrdU)突变细胞突变细胞回复突变受试物用于检测哺乳动物性细胞基因突变的形态学方法。T系小鼠带有7个与毛色、眼色及耳形有关的隐性基因座。C57BL(或3H1)小鼠有相应的显性基因。杂交后所产子代的隐性基因不能表达。将受试物染毒处理的C57BL(或3H1)小鼠与T系小鼠杂交，若受试物可引起小鼠生殖细胞等位基因的突变，则在子代中就会表现出隐性基因的标志。通过检测由突变所致的生化指标变化（变异蛋白质），称为生化法特异座位试验。（六）小鼠特异座位试验(mousespecific-locustest)（七）小鼠可遗传易位试验(mouseheritaobletraslocationtest)用于检测受试物引起雄性小鼠生殖细胞染色体相互易位的作用。给雄性小鼠染毒后，让其与雌鼠交配，当引起易位时，会产生易位复合体的F1代。由于易位导致平衡性染色体改变，可引起胚胎早期死亡，或导致生精过程障碍，表现不育或半不育。在F1代雄鼠中发现不育或半不育者，再检查其精子染色体以证实易位的存在。小鼠特异座位试验及可遗传易位试验中均为阳性：环磷酰胺、环氧乙烷、甲磺酸甲酯、乙磺酸甲酯、丝裂霉素C、乙基亚硝基脲、甲基亚硝基脲、丙烯酰胺、三胺三嗪、盐酸甲节肼、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异丙基甲磺酸甲酯。小鼠特异座位试验阳性：马利兰、二乙基硫酸酪、正丙基亚硝基脲、正丙基甲磺酸甲酯。小鼠可遗传易位试验阳性：噻替派、三亚胺醌、磷酸三甲酯、甲基涕巴。正常细胞仅在S期进行DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在S期以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养法将细胞阻断于G1期，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。如果受试物引起DNA损伤，并启动DNA损伤修复机制，培养液中的3H-胸腺嘧啶核苷就会掺人到DNA链中。DNA的放射活性就间接反映其损伤的程度。常用于UDS检测的细胞：大鼠原代培养肝细胞，外周血淋巴细胞，人成纤维细胞，人羊膜细胞FL株。（八）程序外DNA合成试验(unscheduledDNAsynthesistest，UDS)显性致死主要是由于精子或卵子细胞发生染色体损伤（结构及数目改变），导致受精卵或发育中的胚胎死亡。用染毒的雄性动物与未处理的雌性动物交配，观察胚胎死亡情况。①卵子对诱变物的敏感性相对较低，②受试物可能作用于母体动物，产生不利于胚胎发育的种种干扰因素，影响实验结果的准确性。有些化学物（阿霉素、博莱霉素）在雄性显性致死实验中呈阴性，而在雌性生殖细胞可诱发显性致死。（九）显性致死试验(dominantlethalassay)（十）果蝇伴性隐性致死试验野生型雄蝇(圆形、红色眼)“Basc”雌蝇(棒形、杏色眼)(棒形、杏色眼)(圆形、红色眼)a.每瓶在多于20个F2代(雌和雄)中没有红色圆眼的野生型雄蝇者为致死突变阳性。如有2只以上的红圆眼的野生型雄蝇者为阴性。仅有1只野生型或F2代总数不足20只者为可疑，需进行F3代观察。b.仅存雌、雄亲本而无仔蝇者为不育。染毒组的突变率大于自发突变率的两倍，并有剂量-反应关系者为阳性效应。结果判断四、致突变试验中的一些问题（一）阴性、阳性对照的设立目的是获得实验的基础数据1、阴性对照