Q1：QPCR 设计引物应该注意什么？

A1：（1）扩增产物推荐长度 80-200bp，越短扩增效率越高，为了和引物二聚体做明显区分，长度要大于80bp，太长会导致扩增效率下降；

        （2）3’端尽量避免高GC或高AT含量区域；

        （3）最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T；

        （4）正反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃；

        （5）GC含量最好在40-60%；

        （6）如果后续用探针法，注意探针Tm值高于引物Tm值8-10℃。

Q2：cDNA模板需要稀释吗？应该稀释多少倍进行定量？

A2：没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择CT值落在18-28，或者15-33范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。

注：当使用 cDNA 原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR 反应体系的 1/10，因为 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的组分，cDNA 体积大时风险很高。

Q3：扩增曲线形状异常

A3：(1) 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。建议提高模板浓度重复实验。

       (2) 扩增曲线断裂或下滑：一般由于模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。建议减小基线终点（CT值-4），重新分析数据。

       (3) 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。建议反应前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

       (4) 扩增曲线呈锯齿状且不连续：ROX添加不当。需校正参比染料。

Q4:标准曲线扩增小于90%或者大于120%，线性关系不佳

A4：（1）加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使用不同稀释梯度的浓度更准确；

       （2）标准品降解，重新制备标准品，重复实验；

       （3）模板浓度过高，存在抑制反应，增加模板稀释倍数；

       （4）引物扩增特异性不好，重新设计引物重复实验。

Q5：反应结束无扩增曲线出现

A5：⑴ 反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

        ⑵ 确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃ 延伸阶段。

        ⑶ 引物不合适：重新设计引物；确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

        ⑷ 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

        ⑸ 模板降解：重新制备模板，重复实验。

Q6:CT值的有效性判断

A6: (1) 融解曲线单峰（染料法）

      (2) 扩增曲线指数扩增区域，复孔间CT值STD