处理你的样本

以避免自发荧光 自发荧光通常不是来自样本，而是来自成像前的处理过程。例如，包埋剂、组织培养液和实验室塑料器皿都可能是自发荧光的来源。

如果你正在进行活细胞成像实验，那么考虑在成像前用预热的无酚红培养基或透明的缓冲盐水溶液替换你的正常培养液。除了pH指示剂酚红(440 nm可以激发出高强度荧光)外，培养基和补充剂(如FBS)还可以包含许多蛋白质和小分子，它们本身就有荧光信号，如果不去除它们，所有这些都可以形成强大的自发荧光背景。如果您确实决定将细胞切换到一种新的培养基进行实时成像，重要的是要意识到这可能会导致细胞行为和表型发生意想不到的变化，因此根据您正在研究的内容，您可能需要首先使细胞适应新的培养基。

用同样的显微镜装置预先测量培养皿的自发荧光也是必要的，看看这是否是自发荧光的来源。如果是这样的话，试着去除自发荧光的玻璃底培养皿。

在对暴露于化学物质的活检和组织样本进行成像时，也可以看到类似的问题。一个常见的例子是消化道，如果它暴露在具有强烈荧光特征的抗生素(如四环素)中，它可能会有大量的自发荧光。在这种情况下，用缓冲盐水彻底冲洗或小心使用溶剂就可以很容易地去除荧光。

如果你需要固定细胞，固定方法会对自发荧光有很大的影响。考虑使用福尔马林和戊二醛的替代品，在成像前尽量不要储存固定样本太长时间，因为自发荧光会随着时间的推移而增加。

软件

虽然通过实验设计避免自发荧光是最好的，但有时这是不可能的。在这些情况下，可以通过计算解决你的自发荧光问题。使用您的显微镜软件或开源解决方案(如ImageJ)，可以分析包含自发荧光的像素，并尝试将其从整体图像中减去[1]。不过，请注意，计算方法可能很复杂。有许多不同的方法和算法可供选择，所以最好多尝试几种方法和算法，看看哪种效果好。重要的是要记住，这些方法通常会降低荧光团信号和自发荧光的强度，所以要小心使用，要知道在增加背景的对比度和降低信号强度之间通常是需要权衡的。 软件 虽然通过实验设计避免自发荧光是最好的，但有时这是不可能的。在这些情况下，可以通过计算解决你的自发荧光问题。使用您的显微镜软件或开源解决方案(如ImageJ)，可以分析包含自发荧光的像素，并尝试将其从整体图像中减去[1]。不过，请注意，计算方法可能很复杂。有许多不同的方法和算法可供选择，所以最好多尝试几种方法和算法，看看哪种效果好。重要的是要记住，这些方法通常会降低荧光团信号和自发荧光的强度，所以要小心使用，要知道在增加背景的对比度和降低信号强度之间通常是需要权衡的。

固定后去除自发荧光

一旦你准备好样品并将其储存在冰箱里，就会觉得任何自发荧光都会一直存在。虽然在样品制备阶段消除自发荧光比较容易，但即使在处理后也可以采取一些步骤。

有许多化学处理方法可以减弱自发荧光信号。其中一些是商品化可以买到的，而另一些则可以很容易地用常用的实验室化学品如硼氢化钠、苏丹黑B、乙醇铵等来制备[2，3]。

在显微镜下，光漂白往往具有负面含义，在激光调得稍高的情况下，花了很长时间寻找最佳图像后，会失去荧光信号。然而，对于自发荧光，漂白可以是你的朋友。在添加荧光团之前，您可以用高强度LED灯处理您的样品，以漂白所有的背景自发荧光。之后，您选择的荧光团应该能与漂白的背景​形成更强烈的对比[4]。