双光子吸收/激发：在强光激发下，分子同时吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。 两个光子可以是相同波长的，也可以是不同波长的，但必须是同时吸收（两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒）。可以这样理解，先吸收一个光子的能量跃迁到一个虚拟的中间态，然后再吸收一个光子的能量跃迁到激发态。 双光子显微镜的优点： •        光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究； •        穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；研究表明，共聚焦荧光成像的成像深度一般在50微米左右，而双光子显微镜的成像深度可达1000微米。 •        高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内； •        漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象； •        荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦针孔），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高； •        图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，大大降低了散射的干扰； •        可实现暗场成像：由于荧光波长远离激发波长 •        适合多标记复合测量：许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发光谱宽，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同意生命现象中的不同信息，便于相互对照、补充； •        由于双光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究； •        避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光：生物组织中的自发荧光物质的激发波长一般在350~560nm范围内，采用近红外或红外波段的激光作为光源，能大大降低生物组织对激发光的吸收； •        对探测光路的要求低：由于激发光宇发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比单光子共聚焦显微镜低得多，光学系统也就相对更简单一些； •        降低光学元件在紫外区的色散：用可见光的光学元件，可以获得紫外光区的衍射分辨率； 当然，双光子显微镜也存在一定的局限： ①        为了达到双光子激发的条件，双光子显微镜中的高光子密度可能会导致高次光子间的相互作用，从而在焦点处会产生比普通显微镜中的更快的光漂白现象； ②        由于光源的激发波段通常位于红外和近红外区，所造成的热效应可能会导致样品的热损伤； ③        由于对光源的频率的要求很高，受昂贵的超快脉冲激光器的限制，目前双光子激光扫描荧光显微镜的成本较高；，