1 仪器与材料

1.1 仪器

BCA2248-CW 电子天平、CP225D 十万分之一电子天平，德国Sartorius 公司；HK250 科导台式超声清洗器，上海科导超声仪器有限公司；AM-5250B 磁力搅拌器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HH-S4A 电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；TS-5000Z 型电子舌，日本Insent 公司。

1.2 材料

2 方法与结果

2.1 口尝法评价

2.1.1志愿者筛选经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查批准后，课题组对招募的志愿者进行了包括苦味敏感度等在内的严格筛选，最终选择22 名健康志愿者（男7 名、女15 名）作为受试者，在试验前签订知情同意书。

2.1.2评价方法将样品按照浓度由低到高的顺序进行编号并置于口尝纸杯中，并在样品序列中随机加入1 个阴性样品（纯化水），然后志愿者按编号顺序将样品含于口中，计时15 s ，此间口腔做漱口动作，使舌根和舌侧的苦味感受区能够充分感受药物是否具有苦味，将结果填入“药物苦味评价表”中，然后吐出样品，漱口5 次，至口腔内无苦味，1 ～2 min 后测定下1 个样品。

2.1.3基于BTC 的MB 采用最小极限法测定37 ℃下标准苦味物质和其他各苦味单体水溶液的BTC ，即半数志愿者尝到苦味的最低浓度。以盐酸小檗碱为标准苦味物质，在盐酸小檗碱的BTC 下，其MB 定为1 ，则其他苦味分子的MB ＝C r/ C 。其中C r表示标准苦味物质的BTC ；C 表示未知苦味分子的BTC 。通常情况下，不同苦味分子的BTC 相差较大，因此导致不同物质的MB 数值上差别很大。为此，引入“分子苦度指数”（MB-index ，MBI ），即将MB 取自然对数，以减少数量级差别。

2.1.4 样品配制将盐酸小檗碱配制成浓度分别为3.83 、7.65 、11.50 、15.30 、23.00 、30.60 、61.20 μmol/L的溶液；将苦参碱配制成浓度分别为0.10 、0.20 、0.31 、0.41 、0.61 、0.81 、1.63 mmol/L的溶液；将穿心莲内酯配制成浓度分别为1.15 、1.38 、1.73 、2.07 、2.60 、3.11 、3.89 mmol/L的溶液；将延胡索乙素配制成浓度分别为1.39 、1.85 、2.78 、3.70 、5.55 、7.40 、11.10 mmol/L的溶液；将獐牙菜苦苷配制成浓度分别为0.05 、0.08 、0.10 、0.15 、0.20 、0.31 、0.41 mmol/L 的溶液；将柠檬苦素配制成浓度分别为3.60 、5.40 、7.20 、10.80 、14.40 、21.60 、28.80 μmol/L 的溶液；将葛根素配制成浓度分别为0.41 、0.62 、0.83 、1.24 、1.65 、2.48 、3.30 mmol/L的溶液；将奎宁配制成浓度分别为9.23 、12.30 、18.50 、24.60 、36.90 、49.20 、73.80 μmol/L 的溶液；将芦荟苷配制成浓度分别为15.40 、23.10 、30.80 、46.20 、61.60 、92.30 、123.00 μmol/L的溶液；将柚皮苷配制成浓度分别为0.16 、0.23 、0.31 、0.47 、0.63 、0.94 、1.25 mmol/L的溶液；将盐酸青藤碱配制成浓度分别为20.21 、26.93 、40.42 、53.85 、80.84 、107.70 、161.80 μmol/L的溶液；将栀子苷配制成浓度分别为0.13 、0.19 、0.25 、0.38 、0.51 、0.76 、1.01 mmol/L的溶液；将京尼平苷配制成浓度分别为0.47 、0.71 、0.94 、1.42 、1.89 、2.83 、3.78 mmol/L的溶液；将熊果苷配制成浓度分别为0.73 、1.10 、1.47 、2.20 、2.94 、4.41 、5.97 mmol/L的溶液；将氧化苦参碱配制成浓度分别为3.64 、4.87 、7.28 、9.74 、14.56 、19.48 、29.13 μmol/L的溶液；将益母草碱配制成浓度分别为0.12 、0.18 、0.24 、0.36 、0.48 、0.71 、0.95 mmol/L的溶液；将L - 精氨酸配制成浓度分别为19.80 、26.48 、39.60 、52.95 、79.20 、105.90 、158.00 mmol/L的溶液；将槐定碱配制成浓度分别为6.87 、9.04 、13.73 、18.09 、27.47 、36.18 、54.94 μmol/L的溶液；将龙胆苦苷配制成浓度分别为14.49 、20.71 、29.58 、42.26 、60.37 、86.24 、123.20 μmol/L的溶液。

2.1.5离群值的剔除由于实验对象为生物样本，且不同受试者之间存在个体差异，实验测试数据可能有个别异常值。因此，根据国家标准GBT12315- 2008 中8.2.1 个人表现判定Spearman 相关系数的规定，对所有评价员的数据进行统计分析，当对阴性样品的评价仍为“1 ”，或者违反韦伯- 费希纳定律：刺激量与刺激强度成正比的规律，则剔除该评价员对该组样品的评价结果。

2.1.6 口尝测试结果对上述19 种苦味单体的口尝评价结果进行统计分析，结果表明，19 种苦味单体浓度的对数与感知到到苦味的人数比例成正相关关系，与韦伯- 费希纳定律一致[7-8]。因此，分别对19 种苦味单体感知到苦味的人数比例为0 ～100% 的范围内对不同浓度（C ）下感知苦味的人数比例（P 0）分别做威布尔曲线和对数曲线，二者关系式如下。采用“规划求解”建立威布尔曲线和Excel 建立对数曲线，19 种苦味单体不同的浓度（C ）与感知到苦味的人数比例（P 0，在0 ～100% ）之间的拟合方程见表1 。其中P 0代表感知到苦味的人数比例，C 代表浓度，e 是自然数对数的底数，n 是样品浓度个数。

P0＝f1( C ) ＝β[1－e −( C －α)m/ k ] （1）

P0＝f1( C ) ＝aln C ＋b（2）

C表示浓度，a、b、α、β、m、k为待定参数

由上述拟合方程的R 2可知，19 种苦味物质的威布尔模型均优于对数曲线模型，因此，采用威布尔模型建立19 种苦味物质不同浓度下感知到苦味的人数比例P 0模型。以盐酸小檗碱为标准苦味物质，按照“2.1.3 ”项所述方法分别计算19 种苦味单体的BTC 、MB 以及MBI ，结果见表2 。

2.2 电子舌测定

2.2.1TS-5000Z 电子舌简介TS-5000Z 电子舌，是采用了类似于人类舌头味觉细胞工作原理的人工脂膜传感器技术，可以客观数字化的评价食品或药品等样品的酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味、涩味的先味，同时还可以分析苦味、涩味、鲜味的回味。这个传感器技术的响应状态同人的舌头对味道的响应极为相似，味觉传感器上的脂膜通过与呈味物质之间的静电作用或者疏水性相互作用产生膜电势的变化，并将该电势作为传感器的输出信号传输到电脑进行分析，以此认知味强度及味特征。

2.2.2样品制备

（1 ）正极清洗液配制：准确称量7.46 g 氯化钾，用500 mL 蒸馏水搅拌溶解，然后准确加入300 mL 无水乙醇溶液，边搅拌边加入准确称量的0.56 g 氢氧化钾，溶解完毕后，转移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（2 ）负极清洗液配制：准确量取300 mL 无水乙醇，与500 mL 蒸馏水震荡混合，然后加入8.3 mL 的浓盐酸搅拌混合转移到1000 mL量瓶中，定容，即得。

（3 ）参比液配制：准确称量2.24 g 氯化钾和0.045 g 酒石酸用500 mL 水溶解，然后转移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（4 ）待测样品溶液配制：盐酸小檗碱、苦参碱、穿心莲内酯、葛根素、氧化苦参碱溶液配制方法同“2.1.4 ”项下各样品溶液的配制方法。

2.2.3电子舌测试方法TS-5000Z 型电子舌测量程序：首先在清洗液中清洗90 s ，接着用参比液清洗120 s 、继续用新的参比液清洗120 s ，传感器在平衡位置归零30 s ，达到平衡条件后，开始测试，测试时间30 s ；在2 组参比液中分别短暂清洗3 s ，传感器插入新的参比液中测试回味30 s 。循环测试4 次，去掉第1 次循环，取后3 次平均数据作为测试结果。每次清洗、平衡和测试回味的液体均分布在不同样品杯中。

2.2.4指标选择TS-5000Z 味觉分析系统中常用的指标有先味（relative value ，R ）及回味（change of membrane potentialcaused by adsorption ，CPA ）[5-6]，二者分别表示如下。

R＝Vs－Vr（3）

CPA＝Vr′－Vr（4）

Vr为传感器在参比液中的电势值，Vs为传感器在待测样品中的电势值，Vr′为传感器在参比液中短暂清洗后的电势值

2.2.5传感器的选择TS-5000Z 电子舌共有C00 、AN0 、BT0 、AE1 、GL1 、CA0 、CT0 7 根传感器，其中C00 和AE1 传感器有先味和回味2 种味觉信息，而AN0 和BT0 传感器只输出回味值。因此本实验选取跟苦味有关的4 根传感器，分别为C00 、AN0 、BT0 、AE1 传感器，共输出6 种味觉信息值，具体见表3 。

2.2.6电子舌测试结果

（1 ）不同样品的味觉特征雷达图：图1 显示了不同样品的味觉雷达图，其中横坐标和纵坐标的单位表示味觉的单位，1 个单位代表样品之间浓度相差了20% ，经专业人员鉴定20% 的浓度差异是正常的人能够感觉到的，如果相差低于1 个单位，那么正常的人就不能感觉到样品之间的差异[9]。5 种样品的味觉信息如图1 所示。结果表明，BT0 传感器和AN0 传感器对盐酸小檗碱响应显著，且随着样品浓度的增大，苦味回味也呈增大趋势；苦参碱此浓度范围下C00 传感器和AE1 传感器对苦参碱响应显著，且随着样品浓度的增大，苦味和涩味均呈增大趋势，苦味和涩味的回味很小；葛根素在测量浓度范围内AN0 传感器和C00 传感器响应显著，但是AN0 传感器的响应值随着浓度的增加先增大后减小，C00 传感器响应无规律；对于氧化苦参碱和穿心莲内酯，所有传感器的响应值均较小，不在最佳输出范围内。

（2 ）苦味物质BTC 的确定：以盐酸小檗碱为标准苦味物质，基于口尝法，测得BTC ，然后测得BTC 时的电子舌传感器响应值，对于未知物质，仍然采用电子舌测得其不同浓度的传感器响应值，在与标准苦味物质传感器响应值相同时，未知物质的浓度即为其BTC 。

对不同浓度的盐酸小檗碱的电子舌AN0 和BT0 传感器的测定结果进行统计分析，结果表明，盐酸小檗碱浓度的对数与AN0 传感器和BT0 传感器的响应值（I e ）呈正相关关系，如图2 所示。由表2 可知，盐酸小檗碱的BTC 为10.17 μmol/L，在该浓度下，BT0 传感器的响应值为8.68 ，AN0 传感器的响应值为3.80 。对于苦参碱，其AN0 传感器和BT0 传感器均无响应，仅C00 传感器有响应，但是TS-5000Z 电子舌各传感器测得的味觉信息之间相互独立，不能相互转换，因此，以盐酸小檗碱作为标准苦味物质，未能计算出苦参碱的BTC 。

3 讨论

3.1 标准苦味物质的选择

在进行药物苦味评价时，一般选择奎宁作为标准苦味物质，但因其相对不易得、有一定毒性等原因，在中药苦度评价时，选择盐酸小檗碱比奎宁更具有可比性和代表性[10]。因此，本实验选择盐酸小檗碱作为标准苦味物质。

3.2 苦味单体的选择

常见的中药中具有苦味的化学成分有生物碱、苷类、萜类、苦味肽等[11-13]，对上述19 种苦味物质进行分类，其中，盐酸小檗碱、苦参碱、延胡索乙素、奎宁、氧化苦参碱、盐酸青藤碱、益母草碱、槐定碱属于生物碱类化合物；獐牙菜苦苷、葛根素、芦荟苷、柚皮苷、栀子苷、京尼平苷、熊果苷属于苷类化合物；穿心莲内酯、柠檬苦素、龙胆苦苷属于萜类化合物；L - 精氨酸属于苦味肽类化合物。该部分内容的研究均基于口尝法，选择的苦味单体载体必须对人体无毒害作用，且水溶性要好，由于这些因素的限制，每一类化学成分中选择的载体数量不一。

3.3 BTC预测的影响因素

BTC 为半数志愿者能够感知到苦味的最低浓度，由于评价员味觉灵敏度、个体差异等因素，测得的BTC 会存在一定的差异，因此，实验前应对评价员进行规范化培训，此外，先进的味觉传感器的使用可以弥补口尝法主观性强的缺陷。其次，样品来源不同，纯度高低不同也会影响预测结果，因为本研究中涉及的苦味单体均为中药饮片经提取分离得到，中药饮片化学成分繁多，最终得到的样品中仍会残留有部分杂质，由于味觉神经复杂的传递机制，残留的杂质可能会对苦味的呈现起到协同或拮 抗作用，本研究中使用的单体质量分数均＞98%，使用质量分数更高的单体能够获得更加准确的BTC 。

3.4文献记载的单体BTC与测得BTC的差异

文献中记载的部分单体的BTC 与实验测得的BTC 如表4 所示。文献记载的BTC 和本实验测得的BTC 进行配对t 检验，结果表明2 组数据间不存在显著性差异（P ＞0.05 ），验证了本研究结果的准确性及实验方法的可行性。

3.5 基于电子舌的药物BTC

本研究定义的MB 是基于BTC 的，进行基于电子舌的BTC 预测时，样品溶液浓度的设定与口尝法相同，但实验结果表明，对于氧化苦参碱[17]，在较高的浓度时C00 传感器对其有响应，且随着测试溶液浓度的增高，其响应值也随着增加，但是在对于口尝法测得的BTC 时，其传感器无响应。实验结果表明，对于某些化合物，在较低浓度时，TS-5000Z 电子舌传感器不能与化合物相互作用，进而不能实现对化合物的味觉辨识。因此，灵敏度更高的传感器膜的开发，对于实现电子舌在药物BTC 预测方面具有重要意义。

本研究以生物碱类化合物盐酸小檗碱作为标准苦味物质，对于TS-5000Z 电子舌，其AN0 和BT0 两根苦味传感器能对其产生特异性响应，而苦味传感器C00 则不响应，这3 根传感器的响应值之间相互独立，彼此之间不能转化，因此，若某种苦味物质采用TS-5000Z 传感器测定时，对AN0 和BT0 传感器能够产生响应，则可以采用本研究的方法预测其BTC ，而本研究选择的载体，没有对AN0 传感器和BT0 传感器产生响应的物质，在后续的研究中，应扩大研究载体，筛选能够对AN0 传感器和BT0 传感器产生响应的物质，对此方法的可行性进行验证。同时，可尝试选择不同味觉辨识机制的味觉传感器，建立对所有苦味物质均适用的预测BTC 的方法。

3.6苦味的呈味机制探讨

苦味分子可略分2 类[18-19]：一类含仅具有限水溶性的疏水亲脂性物质，诸如萜类等；另一类含强极性化合物，这类物质若不仅能有效地干扰苦味受体的静电相互作用，也仍能形成强的疏水相互作用，如奎宁、咖啡因等生物碱[20]。有研究表明，一些结构类似的化合物具有类似的苦味性质，然而其空间同分异构体构型不同往往又表现出不同的性质。如，L - 色氨酸是典型的苦味化合物，然而其D 型的对应异构体却表现出了甜味的性质；槲皮素只有轻微的涩味，但是其相同浓度的同分异构体却具有很强的苦味；橘皮苷没有苦味，然而其位置异构体却具有很强的苦味[21]。此外化合物的苦味有时还与其所处的环境存在着密切关系，如亚麻油酸在溶液中只有很弱的苦味，而在乳剂中却表现出很强的苦味[22-23]。

苦味化合物在自然界中分布广泛，纵观国内外的研究，苦味与化合物的结构有一定的关系，但是目前仍不能阐明苦味由何而来。研究者们曾认为化合物中疏水基团决定了分子的苦味，但是如之前所述，同分异构体能表现出截然不同的苦味性质，这表明空间结构也对苦味性质极为重要。近年来，很多关于预测化合物苦味的模型被建立起来，如Rodgers 等[24]利用已知的近2 万种苦味化合物和非苦味化合物建立的模型，在已知的化合物中，对苦味化合物的辨别能力达到72% ，但是该模型筛选出来的化合物只有极少数（33 个）被验证具有苦味。按照现在的研究成果，对从未尝过的化合物判断其苦味性质还是非常困难的，这也和苦味化合物与受体的结合机理有关，仍需要进一步的探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：高晓洁，白明学，桂新景，王艳丽，王君明，姚 静，张 璐，施钧瀚，李学林，刘瑞新．基于苦味阈值浓度的药物分子苦度定量方法研究[J]. 中草药, 2022, 53(3): 696-703 .返回搜狐，查看更多