阅读量：

209

作者：

陈璐璐

展开

摘要：

背景: 苍耳子Fructus Xanthii是临床上常用的中药材,根据中华人民共和国药典(2010年版)记载,苍耳子为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞的果实,具有散风除湿,通鼻开窍的功效,主要用于治疗鼻炎,痹痛,风疹等疾病.大量古代文献指出,苍耳子有小毒.然而,中国药典对苍耳子只进行了定性,浸出物检测,用法用量等基本描述,却没有就苍耳子的毒性成分进行描述或其检测项目.为了加强对苍耳子的质量控制,尤其是对苍耳子毒性成分的定量研究迫在眉睫. 苍耳子中主要含有挥发油,倍半萜内酯化合物,酚酸类,毒蛋白,氢醌及苷类等化学成分.关于苍耳子毒性成分,各学者看法不一,主要涉及到的化合物有倍半萜内酯类化合物,苍耳苷,毒蛋白和氢醌.有研究从苍耳子的脱脂水浸剂中提取分离出的黄白色结晶状的苍术苷及其衍生物,该类化合物引起的中毒症状和苍耳子水煎剂所表现的症状基本相同,因此中药学术界普遍认为苍耳子的毒性成分与苍术苷及其衍生物有关. 苍术苷及其衍生物属于贝壳杉烯毒苷(kaurene glycoside),是一类天然植物性毒素,分布在我国一些常用中草药,如:苍耳子,苍术等药典收载的常用品种中.该类毒物中毒的临床表现为:致命性的广泛肝坏死,并伴有低血糖及肾衰竭[1-4].因服用含贝壳杉烯毒苷的传统草药而导致中毒甚至死亡的事件在北非地区和地中海国家常见报道[5-7],我国也有不少苍耳子中毒的临床案例报道[8-13].这些含贝壳杉烯毒苷的中药材在中成药复方制剂中广泛存在且应用频率很高.以苍耳子为例,中国药典(2010版)收载的苍耳子复方制剂达11种,包括中医临床常用的通窍鼻炎片,鼻渊舒等,而收入部颁标准的制剂则多达39种,几乎涉及所有的鼻炎用药.然而,即便是应用如此之广,这些含贝壳杉烯毒苷类化合物的中草药及其配伍方剂的质量控制,配伍解毒物质基础及分子机制的研究并未引起我们足够的重视,甚至连毒性成分的检识,分析都还是问题.这种毫不设防,或者出现了毒性反应也无以应对的现状实在令人堪忧.国际社会在对中草药趋向于接受的同时,对其安全性的关注程度也越来越高."马兜铃酸"事件以及相关法规的制定,已给中草药的应用和国际化造成了严重的负面影响,如果不能对含贝壳杉烯毒苷类化合物的中草药及其制品作出迅速的反应和主动的关注,对含此类植物毒素的中草药及其制品的限制也不过是时间的问题. 历代学者尝试使用各种方法将苍耳子的毒性去除,有古书记载:"炒令香,捣去刺,使腹破".以后主张去刺者颇多,现在仍沿用此法.根据《中国药典》2010年版规定:"取净苍耳子,照清炒法炒至黄褐色,去刺,筛净".苍耳子为什么先炒再去刺,文献未见明确记载.面对苍耳子的刺是否含有毒性成分,含量是多少,苍耳子刺究竟该不该去,去刺和炒制是否能够达到减毒的目的,一直是个疑问.为了弄清楚这些问题,本研究将针对苍耳子生品和炮制品的刺,果壳,种壳,种仁,分别测定毒性成分苍术苷的含量,以证实传统炮制方法是否合理,为苍耳子减毒研究提供参考依据. 在临床上,苍耳子药材及其制品运用广泛,但缺乏对苍术苷的定量检测,严重影响了其临床应用的安全性.本研究采用高分离度的液相/质谱分离技术,尝试建立更科学,准确和迅速的苍术苷含量检测方法,应用于苍耳子药材及其制品以及生物样品中该毒性成分的测定.研究对于临床医生科学合理地应用这一毒性中药,减少不良反应的发生具有指导意义. 苍术苷的毒代动力学研究国内外尚未见报道,运用毒代动力学实验来描述苍术苷的体内过程,对于揭示该毒性成分在动物体内的毒性机制,完善苍耳子的质量评价极为重要.本研究初步探讨了苍耳子药材提取物在大鼠体内的毒代动力学特征,同时辅以大鼠血清的各项生化指标的变化和肝脏组织形态学的观察来评估苍耳子对大鼠肝脏造成的损害程度与剂量和时间的关系. 目的: 1运用LC-MS/MS建立苍耳子药材中苍术苷的定量检测方法,考察苍耳子生品和炮制品药材不同植物部位,包括刺,果壳,种壳,种仁中毒性成分苍术苷的含量,通过苍耳子生品与炮制品刺,果壳,种壳,种仁中苍术苷含量的比较,考察传统认为最重要的毒性贮存器官刺中毒性成分的含量,为传统中医药理论关于苍耳子的"炒制去刺"减毒的科学性和合理性提供数据支撑,也为毒性中药的炮制理论提供科学依据. 2针对市售常用的苍耳子制品进行苍术苷的定量检测,提升苍耳子制品的质量评价水平,为苍耳子制剂的安全应用提供支持. 3建立血浆样品中苍术苷的定量分析方法,并应用于大鼠毒代动力学研究.在不同时间点,检测大鼠血清中的苍术苷含量,了解苍术苷在大鼠体内的动力学过程;同时,在特定时间点检测大鼠血液内的各项生化指标,以及肝组织形态学观察,以考察苍耳子对大鼠肝脏造成的损害与剂量和时间的关系. 方法: 1苍耳子药材中苍术苷定量检测方法建立:运用AgiLent6460RRLC-MS/MS快速液相色谱串联三重四极杆质谱仪,使用电喷雾离子化和负离子多反应离子监测(MRM)方式,色谱柱为AgiLent Zorbax RX-SIL(2.1×150mm,5μm),流动相为乙腈-10mmoL/L乙酸铵溶液(85:15),流速为0.2mL/min,柱温:35℃.用电喷雾离子化和负离子多反应离子监测(MRM)方式检测苍术苷;用于定量分析的离子对为m/z725.1→645.2;干燥气温度:325℃;干燥气流速:6L/min;雾化气:30psi;毛细管电压:3000V;喷嘴电压:1500V;鞘气温度:350℃;鞘气流速:11L/min.将苍耳子药材的种壳,种仁,果壳,刺分离,于60℃干燥12h,经粉碎后过40目筛,分别称取各个部分约0.2g,置于圆底烧瓶中,加入100mL纯水,回流提取6.5h,摇匀,取适量离心(13000r/min)3min,精密量取10μL上清液,加入50μL内标工作液和840μL50%乙腈,过滤后待测.通过绘制标准曲线,然后对此方法进行精密度,重复性,稳定性,回收率的考察,运用该方法对苍耳子药材及其制剂中所含的苍术苷进行定量检测. 2血浆中苍术苷的定量检测方法建立:本文采用固相萃取法处理血浆样品,建立了以对乙酰氨基酚为内标的RRLC-MS/MS体内分析方法.采用Merck ZIC-HILIC柱(2.1×150mm,5μm);流动相为乙腈10mmoL/L乙酸铵溶液(81:19);流速为0.2mL/min;柱温:35℃.用电喷雾离子化和负离子多反应离子监测(MRM)方式检测苍术苷;用于定量分析的离子为m/z725.1→645.2;干燥气温度:325℃;干燥气流速:6L/min;雾化气:30psi;毛细管电压:3000V;喷嘴电压:1500V;鞘气温度:350℃;鞘气流速:11L/min.将空白大鼠血经常温离心(3000rpm,15min)后,精密吸取上清液200u L,加入对乙酰氨基酚(2u g/mL)10μL,涡旋混匀.先后用1mL甲醇和蒸馏水对HLB柱进行活化与平衡,使含内标的混合物恒速通过SPE柱,用1mL10mmoL/L乙酸铵溶液洗涤SPE柱,抽干,和1.5mL甲醇洗脱,收集洗脱液,35℃水浴中用N2流吹干.残留物用50%乙腈200μL充分溶解后,离心(0.22μ m滤膜),得到待测样品,进样量为5μ L,绘制标准曲线及进行定量下限,精密度,稳定性,回收率的方法学考察. 3苍术苷在动物体内的毒代动力学研究:苍耳子提取物灌胃大鼠,其半数致死量为140.8g生药/kg.本实验设计成年健康SD大鼠单次灌胃给予低,中,高剂量的苍耳子的提取物,分别为12.5g/kg,25g/kg,50g/kg,相当于大鼠口服苍术苷LD50的1/12,1/6,1/3,折算为苍术苷的量分别是11.4mg/kg,22.8mg/kg,45.6mg/kg.分别于给药前及给药后2,5,8,10,15,20,2,30,45min,1,2,3,5,8,12,24,34,48h从大鼠眼眶后静脉丛采血,常温离心(3000rpm,15min)后,精密吸取上清液200μ L,加入对乙酰氨基酚(2μg/mL)10μL,涡旋混匀.先后用1mL甲醇和蒸馏水对HLB柱进行活化与平衡,使含内标的混合物恒速通过SPE柱,用1mL10mmoL/L乙酸铵溶液洗涤SPE柱,抽干,以1.5mL甲醇洗脱,收集洗脱液,35℃水浴中用N2流吹干.残留物用50%乙腈200μ L充分溶解后离心(0.22μ m滤膜),得到待测样品,经自动进样器进样5μ L,运用上述LC/MS/MS方法检测血浆样品中苍术苷含量.应用DAS软件的非房室模型法计算药物动力学参数.同时观察苍耳子药材对大鼠血液内各生化指标,及肝脏组织形态学变化的影响. 结果: 1建立苍耳子药材中苍术苷的定量方法:苍耳子药材的种壳,种仁,果壳,刺中苍术苷的含量测定,标准曲线在0.505～505ng/mL内线性关系良好(r=0.9996),50%,100%及150%水平的平均回收率分别为(97.63±1.97)%,(94.04±1.35)%,(92.53±1.01)%;苍耳子片剂,丸剂中苍术苷的含量测定方法,标准曲线在0.505-505ng/mL内线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为(105.00±4.33)%;苍耳子颗粒剂中苍术苷的含量测定方法,标准曲线在0.505～505ng/mL内线性关系良好(r=0.9993),平均回收率为(92.35±6.01)%. 2苍耳子生品种壳,种仁,果壳,刺中的苍术苷含量分别为:116.5,5037,25.88,64.35μ g/g;炮制品种壳,种仁,果壳,刺中的苍术苷含量分别为:38.58,5640,6.497,19.57μ g/g.生品的种壳,种仁,果壳,刺中苍术苷含量分别为炮制品的该成分的3.02,0.893,3.98,3.29倍. 3建立血浆中苍术苷的定量方法:大鼠血浆样品中苍术苷的含量测定,标准曲线在0.5-500ng/mL内线性关系良好(r

展开

关键词：

苍耳子 毒性成分 液-质联用 含量测定 毒代动力学

学位级别：

硕士

学位年度：

2013

被引量：

11