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作者：

曲玥阳

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摘要：

微环境对维持细胞的活性和功能起到重要作用。作为肾脏的基本结构和功能单元,肾单位具有肾小球滤过和肾小管重吸收、分泌等功能。由于肾单位特殊的结构和功能,不同种类、不同区域的细胞所处的微环境有较大差异。体外实验影响因素少、条件可控,在研究肾脏损伤机制和药物筛选中占据重要地位。但现有的二维和三维体外培养平台仿真度低,难以模拟肾脏复杂的微环境。微流控平台具有流体可控、设计组合灵活等优点,辅以具有生理功能的细胞与仿生的细胞排布,有可能构建具有相似结构和核心功能的肾芯片。目前已有肾芯片相关报道,但现有工作使用的具有功能的细胞种类少,只模拟了肾单位的部分节段,不能在一个系统内完整实现物质经肾小球滤过、肾小管分泌或重吸收的生理过程,结构和功能的仿真度较差。为探讨和验证提高肾芯片仿真度的关键因素,本文首先由简单到复杂,分别设计并构建了单层肾小管上皮细胞芯片、肾小管管周芯片以及同时具有肾小球单元和肾小管单元的肾单位芯片。其中前两种芯片能够初步模拟肾小管相应功能,肾单位芯片能够初步模拟体内肾脏中物质在结合态和游离态之间的转换、肾小球滤过、肾小管分泌、肾小管重吸收等四个物质经肾消除的重要环节。随后对肾单位芯片具有相对完整的结构和功能的必要性进行验证,并对肾单位芯片的功能及潜力进行探讨。论文的第一步部分开发了构建肾单位模型所需细胞的分离和提取方法。使用该方法可以通过一次实验,从同一只大鼠的肾脏中,同时获得原代肾足细胞、肾小管管周血管内皮细胞、肾小管上皮细胞。通过比较不同组织获取方法对细胞活性的影响,胶原酶的种类和消化时间的选择对获取组织的纯度和活性的影响,不同包被条件对三种原代细胞的增殖和功能维持情况的影响,不同培养液成分对肾小管上皮细胞和足细胞的活性和功能维持的影响,确定了最优分离、培养方案。论文的第二步部分描述了两种肾小管芯片的构建方法,以“夹膜”式为基本结构,利用种有肾小管上皮细胞的多孔膜构建单层肾小管上皮细胞芯片,利用分别种有肾小管管周血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的多孔膜构建肾小管管周芯片。考察了肾小管管周血管内皮细胞和肾小管上皮细胞形成的细胞层的致密性和功能;考察了肾小管芯片对于细胞功能在体外重建的影响;考察了在肾小管芯片中形成细胞极性对顺铂致损伤评估结果的影响;比较了两种肾小管芯片在顺铂致肾小管损伤评估中的仿真性。与单层肾小管上皮细胞芯片相比,肾小管管周芯片从结构上以及在顺铂肾毒性评价的表现中都更为接近体内情况。论文的第三部分,描述了一种肾单位芯片的构建方法。该方法以“夹膜”式为基本结构,利用种有大鼠原代肾足细胞、血管内皮细胞的多孔膜构建肾小球单元,利用种有大鼠原代肾小管上皮细胞、血管内皮细胞的多孔膜构建肾小管单元。肾小球单元具有分子尺寸和电荷选择性滤过功能,肾小管单元具有对氨基马尿酸分泌和葡萄糖重吸收功能。在“人工血液”里添加血清白蛋白,促进细胞功能重建。比较了肾单位芯片和单层肾小管上皮细胞芯片以及肾小管管周芯片在顺铂致肾小管损伤评估中的仿真性。与另两种肾小管芯片相比,肾单位芯片从结构上以及在顺铂肾毒性评价的表现中都更为接近体内情况。论文的第四部分,以药致肾损伤为例,探讨了肾单位芯片的功能及潜力。该芯片可以用于考察不同浓度的顺铂作用下,肾小球单元和肾小管单元细胞的损伤情况;比较顺铂和阿霉素对肾单位芯片的肾小球单元和肾小管单元细胞的损伤顺序;考察顺铂和阿霉素对肾单位芯片的肾小球单元和肾小管单元细胞功能蛋白表达的影响;探讨在“人工血液”里添加血清白蛋白对顺铂和阿霉素所致肾损伤的影响。部分数据与已报道的体内结果相近,表明肾单位芯片在药致肾损伤研究中有较大的应用潜力。本文设计并构建的肾单位芯片,初步模拟了体内肾脏中药物在结合态和游离态之间的转换、肾小球滤过、肾小管分泌、肾小管重吸收等四个对药物肾毒性的影响较大动态过程。与现有细胞实验平台相比,该芯片在结构和功能上具有更高的仿真性。该肾单位芯片可用于体外测试药物肾毒性,研究肾的功能,特别是肾损伤致病机制,有望填补现有体外研究缺乏高仿真度模型的空白,成为肾脏疾病研究的有力武器,从而在寻找新的治疗靶点及药物研发中占据重要地位。

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关键词：

微流控 肾单位芯片 仿生 体外研究模型 功能重建