芋螺毒素数据库

1.芋螺简介

芋螺（Conus spp., cone snails）是一类海洋肉食性软体动物，全世界大约有700种，主要分布在热带和亚热带海域[1]（图 1）。根据食性的不同，可将芋螺分为3类，即食虫芋螺（vermivorous）、食螺芋螺（molluscivorous）和食鱼芋螺（piscivorous）。其中食虫芋螺的数量最多，占全部芋螺种类的70%左右，但食鱼芋螺的毒性最大。

图1. 芋螺的全球地理分布图

2. 芋螺毒素的分类

芋螺通过分泌毒液来捕食猎物和防御天敌。每种芋螺的毒液中含有约2000种不同的小肽，称为芋螺毒素（conopeptide或conotoxin，图2）。芋螺毒素是迄今为止发现的分子量最小的一类多肽毒素，通常由10~40个氨基酸残基组成，具有分子量小、半胱氨酸丰富、序列多变、靶点专一等特点。芋螺毒素能特异地作用于电压门控或配体门控离子通道，因此有望成为神经科学研究的新型工具和治疗相关疾病的新型药物。

目前已鉴定出的芋螺毒素有1,700多种。随着基因组、转录组和蛋白质组等技术的快速发展，越来越多的芋螺毒素不断地被预测和鉴定出来。目前，芋螺毒素主要有以下三种分类方式[2]：

（1）基因超家族（Gene superfamilies）：按照信号肽序列分类，可以分成30个超家族，包括A、O、M、P、I、T等等。

（2）半胱氨酸模式（Cysteine frameworks）：按照半胱氨酸（或二硫键）模式，可以分成32类，包括Ⅵ、Ⅶ、Ⅺ等等。

（3）药理学活性（Pharmacological families）：按照药理学活性，可分为12类，包括α、ι、κ等等。 

图2. 芋螺及芋螺毒素的多样性。

3.芋螺毒素的作用靶点

经过长期的分析研究，人们对芋螺毒素的生理特性和功能已经有了较为清晰的认识。不同种类的芋螺毒素可以作用于不同的靶点，有些芋螺毒素还能区分同一靶点的不同亚型。目前，芋螺毒素作用的靶点主要包括三大类[3]：

（1）配体门控离子通道：诸如乙酰胆碱受体（图3A-D）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体、5-羟色胺受体；

（2）G蛋白偶联结合受体（图3E）；

（3）电压门控离子通道：包括钠、钾、钙等离子通道（图3F）。

研究发现，这些受体或通道与某些重大疾病密切相关，如疼痛、帕金森综合征、精神性疾病、乳腺癌等。因此，开发针对此类靶点的相关药物，是治疗这些疾病的关键。

图3. 芋螺毒素作用靶点。（A-D）神经型乙酰胆碱受体;（E）G蛋白偶联受体；（F）电压门控钙离子通道结构

4.芋螺毒素多组学研究进展

4.1基因组

十多年前，有团队尝试解析红枣芋螺（C. bullatus）基因组[6]。但由于诸多限制，这项研究只获得大量的碎片化DNA序列，因而只能描述一些简单的基因组学特性，例如GC 含量、基因组大小。五年后，爱猫芋螺（C. tribblei）的部分基因组测序数据被公布[7]。2018年，科学家利用靶向测序技术，成功解析了 32 种芋螺基因组中芋螺毒素基因的结构和外显子序列[8]。目前，NCBI数据库中还有耸肩芋螺（C. consors）的基因组数据(GCA_004193615.1) ，可供大家获取，以用于比较分析。

2021年2月，华大海洋在Nature子刊Cell Discovery上发表了全球首个芋螺（桶形芋螺，C. betulinus）的全基因组序列图谱[9]。该研究同时采用Illumina二代短片段、 PacBio三代长片段和Hi-C测序策略，并整合转录组和多肽组数据，首次揭示了芋螺毒素表达的代表性中心法则，即总基因：转录本：蛋白质：翻译后修饰毒素肽的序列条数比值约为1:1:1:10s。当然，这一比例可能是这种虫食性芋螺所特有的，不同种芋螺在芋螺毒素基因、转录本和多肽数量方面存在着很大的差异。

2021年5月，地中海芋螺（C. ventricosus）的基因组图谱发布[10]，其大小为3.59 Gb，与桶形芋螺3.43 Gb的基因组大小相近。但是，这两个基因组均只有部分序列（低于50%）装配到了35条片段化的染色体上（图4）。

图4. 地中海芋螺部分染色体图谱及毒素在基因组上的分布[10]

测序技术的革新和分析软件的优化让基因组组装变得更加容易，但芋螺基因组研究的难点还在于如何提取到高质量的DNA以用于构建长片段的测序文库，这也是很多软体动物基因组研究正在面临的难题。

4.2 转录组

2011年，第一个芋螺（红枣芋螺）转录组被发表[6]，这项开创性研究虽然只发现30条新型芋螺毒素序列，但首次揭示了芋螺毒素主要在毒管中表达，且提供了高效预测芋螺毒素的详细分析流程。

近些年来，芋螺转录组研究呈爆发式增长，研究团队主要来自美国、澳大利亚和中国。研究数据显示，不同样本中芋螺毒素转录本总数从几十到几百不等，例如，华大海洋科研团队分别从桶形、独特、将军、橡木4种芋螺转录组中鉴定到芋螺毒素序列215、118、61、48条。采用样本有的是单个个体，有的是多个个体的混合；有的来自于单个组织，有的则是多个组织的混合样。因而，芋螺样本的不同组织来源和不同发育阶段成为很多研究的关注点。

例如，华大海洋科研团队从桶形芋螺的多个转录组中，共鉴定到215条芋螺毒素转录本序列，但不同样本中所鉴定到的毒素肽数量差异很大[11]。其中，通过表达序列标签（EST）文库筛选到46条，毒管混样中鉴定到123条，大、中、小个体的毒管中分别有95、94、98条，而中体型个体的毒囊中只有39条。芋螺的毒管是主要的芋螺毒素合成器官，所以很好理解毒囊中的芋螺毒素肽数量（39）不到毒管（94）的一半；其中，28条毒素序列为两种组织共有， 66条为毒管所特有，11条为毒囊特有。此外，不同发育阶段个体中的毒素种类和数量也存在差异，当然发育阶段的差异也可能包括个体差异。该研究发现，大、中、小不同体型个体仅有36条相同的芋螺毒素序列，两两之间（小+中、中+大、大+小）有约50条为共有，远小于单个个体鉴定到的芋螺毒素数量（图5）。

图5. 桶形芋螺不同样本中芋螺毒素种类和数量存在差异[12]

目前已有的芋螺转录组数据依然十分有限。芋螺毒素的种类、数量、表达特性等在不同的芋螺种类、个体、发育阶段、组织等中存在众多方面的差异，仍需更多的数据支撑和深入验证。

4.3 蛋白组

蛋白质谱很早就被应用到对芋螺毒液的分析研究中，但因耗时长、通量低等缺点，一直难以规模化推广应用[12]。近年来，随着质谱系统的改进和生物信息分析技术的发展，实验所需的毒液总量大大减少，蛋白组已成为一种高效的新型毒素鉴定方法，并被广泛应用于蛇、蜘蛛、蝎子、芋螺等有毒动物的毒素蛋白或多肽序列分析[12]。该技术可提供蛋白质的翻译后修饰信息，而这些恰恰是其它组学方法所无法提供的，因而成为对基因组和转录组数据的很好补充手段。

传统的蛋白组测序需经过前期对芋螺毒液样本的预处理，以避免二硫键丢失对结果造成影响。处理方法包括还原、烃化、酶解等，该过程可能还是会丢失部分多肽信息，主要适用于分析成分复杂的毒液。相反，新型蛋白组测序可保留完整的二硫键，更适用于分析成分简单的多肽（如经过分离纯化后的毒液）。将这两种方法进行有机结合，可以找到更多的芋螺毒素成熟肽的酶切位点[13]。

与转录组结果类似，蛋白组数据也显示不同种类（特别是不同食性）芋螺所含有的芋螺毒素种类和序列数量有很大差异，因为食性偏好是影响芋螺毒素进化的重要因素之一[14]。此外，采用不同的蛋白组检测手段也会影响到最终的芋螺毒素鉴定结果。例如，桶形芋螺毒液的蛋白组研究显示，TripleTOF 5600只能检测到773条多肽，而相同样本用 QExactive HF系统却可检测到1522条 [9]。大理石芋螺（C. marmoreus）的毒液蛋白组研究结果显示，MALDI-TOF能检测出2710种多肽，搭配电喷雾的ESI-Q-TOF可以检测到3172种多肽，而搭配离子源的ESI-Q-TOF检测出的多肽数量高达6254种 [15]。综上可见，芋螺毒液蛋白组的结果很大程度上依赖于样本处理方法和质谱仪器的灵敏度。

5. 华大海洋在芋螺研究领域获得的科技成果汇总

5.1 发表全球首个芋螺基因组图谱

2021年2月，华大海洋联合海南医学院和解放军军事科学院防化研究院，成功破译了全球首个芋螺（桶形芋螺）的全基因组序列，揭示了芋螺毒素表达的中心法则，相关成果发表于Nature子刊Cell Discovery（图6）。

该研究首次阐明了“芋螺毒素基因→毒素转录本→毒素蛋白→翻译后修饰毒素肽”的最重要、最基本的生物学规律，在探索芋螺毒素的本质及普遍规律方面发挥重要的指导作用，奠定了芋螺毒素研究的理论基石，是芋螺及芋螺毒素研究领域里的重要突破性进展（www.bgimarine.com/news/detail/180）。

图6. 华大海洋发表全球首个芋螺基因组[9]

5.2 获批设立院士（专家）工作站

2018年，深圳市科协系统工作会议暨首批院士（专家）工作站授牌仪式在深圳科学馆举行。深圳华大海洋科技有限公司作为获批设立首批深圳市院士（专家）工作站的企业代表参加授牌仪式。

该工作站（图7）由深圳华大海洋科技有限公司和中国工程院陈冀胜院士团队在深圳市联合组建。双方强强联手，开展“新型海洋功能多肽的高通量挖掘与活性研究”和“海洋药物及保健食品研发”。工作站以隶属华大海洋的深圳市华大海洋研究院为依托，促进华大海洋与陈冀胜院士及其创新团队实现资源共享、优势互补（www.bgimarine.com/news/detail/37）。

图7. 华大海洋成立深圳市院士（专家）工作站

5.3  出版专著《海洋芋螺资源图鉴》

2018年，华大海洋石琼教授与海南医学院高炳淼副教授牵头编著《海洋芋螺资源图鉴》（图8）。该书是国家基因库系列丛书中的一部，由中山大学出版社出版，成为深圳市华大基因学院和中国科学院大学华大教育中心海洋药物研发领域的研究生教材。

本书对海洋芋螺资源进行了系统总结。详细介绍芋螺的形态与分类，并提供大量翔实的全球芋螺高清图片；同时，对芋螺毒素及其应用研究做了概括性综述。本书的第三部分（芋螺名录与索引），提供了芋螺种类拉丁文与中文对照信息，为芋螺分类研究提供指导。

图8. 华大海洋出版专著《海洋芋螺资源图鉴》[3]

5.4 申请和获批系列专利

截止目前，华大海洋已申请芋螺毒素相关发明专利20件，其中16件已获得授权，包括欧洲授权专利6件、美国授权专利5件、中国授权专利5件。

1.[发明专利] Conotoxin polypeptide Κ-CPTX-BT101 and method for preparation thereof and application thereof，美国，2018，US10087216B2。

2.[发明专利] Conotoxin polypeptide KAPPA-CPTX-BT102 and method for preparation thereof and application thereof，欧洲，2019，EP3202776B1。

3.[发明专利] Conotoxin polypeptide KAPPA-CPTX-BT103 and method for preparation thereof and application thereof，欧洲，2019，EP3202782B1。

4.[发明专利] Conotoxin polypeptide KAPPA-CPTX-BT104 and method for preparation thereof and application thereof，欧洲，2019，EP3202775B1。

5.[发明专利] Conotoxin polypeptide KAPPA-CPTX-BT105 and method for preparation thereof and application thereof，欧洲，2019，EP3202778B1。

6.[发明专利] Conotoxin peptide Κ-CPTX-BTL01 preparation method thereof and uses thereof，美国，2019，US10501498B2。

7.[发明专利] Conotoxin peptide Κ-CPTX-BTL02 preparation method thereof and uses thereof ，美国，2019，US10246490B2。

8.[发明专利] Conotoxin peptide KAPPA-CPTX-BTL03 preparation method thereof and uses thereo，欧洲，2019，EP3252071B1。

9.[发明专利] Conotoxin peptide KAPPA-CPTX-BTL04 preparation method thereof and uses thereof，欧洲，2019，EP3239166B1。

10.[发明专利] Conotoxin peptide Κ-CPTX-BTL04 preparation method thereof and uses thereof，美国，2019，US10179802B2。

11.[发明专利] Conotoxin peptide Κ-CPTX-BTL03 preparation method thereof and uses thereof，美国，2020，US10556927B2。

12.[发明专利] 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl01及其制备方法及应用，中国，2021，2014800839490。

13.[发明专利] 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl02及其制备方法及应用，中国，2021，2014800839503。

14.[发明专利] 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl04及其制备方法及应用，中国，2021，2014800839537。

15.[发明专利] 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl03及其制备方法及应用，中国，2021，2014800839541。

16.[发明专利] 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl05及其制备方法及应用，中国，2021，2014800839556。

5.5 获批政府经费支持

华大海洋共获批芋螺相关的政府专项5项。

1.海洋863“海洋生物功能蛋白高效发掘与产品开发”（2014AA093501）子课题：经费140万元，由国家科技部资助，2014.1-2016.12。

2.深圳市大鹏新区产业发展专项“转录组测序技术支撑的新型芋螺毒素研发” （KY20150207）：经费50万元，由大鹏新区经服局资助，2016.1- 2017.12。

3.深圳市科技计划国际合作研究项目“基因组学和生物信息学支撑的新型海洋药物研发” （GJHZ20160229173052805）：经费40万元，由深圳市科创委资助，2016.8- 2018.8。

4.深圳市院士工作站—基因组学支撑的新型海洋药物研发（SZYSGZZ-2018001）：经费50万元，由深圳市科协资助，2017.12-2020.12。

5.大鹏新区产业发展专项“芋螺毒素来源的戒毒制品研发”（KJYF202001-17）：经费30万元，由大鹏新区经服局资助，2020.1-2021.12。

5.6 发表相关论文

截止目前，华大海洋已经发表相关SCI论文8 篇，不仅涉及基因组、转录组、多肽组等多组学理论研究，还涉及芋螺毒素的结构预测、活性筛选、功能验证等应用基础研究，为全面解析芋螺及芋螺毒素提供支撑，也为芋螺毒素相关药物研发提供指导。

1. Peng C., Huang Y., Bian C., Li J., Liu J., Zhang K., You X., Lin Z., He Y., Chen J., Lv Y., Ruan Z., Zhang X., Yi Y., Li Y., Lin X., Gu R., Xu J., Yang J., Fan C., Yao G., Chen J.-S., Jiang H., Gao B., Shi Q. The first Conus genome assembly reveals a primary genetic central dogma of conopeptides in C. betulinus. Cell Discovery, 2021, 7(1):11. 

2.Yao G., Peng C., Zhu Y., Fan C., Jiang H., Chen J., Cao Y., Shi Q. High-throughput identification and analysis of novel conotoxins from three vermivorous cone snails by transcriptome sequencing. Marine Drugs, 2019, 17(3):193.

3.Gao B., Peng C., Chen Q., Zhang J., Shi Q. Mitochondrial genome sequencing of a vermivorous cone snail Conus quercinus supports the correlative analysis between phylogenetic relationships and dietary types of Conus species.  PLoS One, 2018, 13(7):e0193053.

4. Gao B., Peng C., Zhu Y. Sun Y., Zhao T., Huang Y., Shi Q. High throughput identification of novel conotoxins from vermivorous Oak cone snail (Conus quercinus) by transcriptome sequencing. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(12):3901.

5. Gao B., Peng C., Lin B., Chen Q., Zhang J., Shi Q. Screening and validation of high-efficient insecticidal conotoxins from a transcriptome-based dataset in Chinese tubular cone snail.  Toxins, 2017, 9(7):214.

6.Gao B., Peng C., Yang J., Yi Y., Zhang J., Shi Q. Cone snails: a big store of conotoxins for novel drug discovery. Toxins, 2017, 9(12):397.

7.Huang Y., Peng C., Yi Y., Gao B., Shi Q. A transcriptomic survey of ion-channel based conotoxins in Chinese tubular cone snail (Conus betulins). Marine Drugs, 2017, 15(7):228.

8.Peng C., Yao G., Gao B., Fan C., Wang J., Cao Y., Wen B., Zhu Y., Ruan Z., You X., Bian C., Li J., Lin Z., Zou S., Zhang X., Qiu Y., Chen J., Coon S.L., Yang J., Chen J.-S., Shi Q. High-throughput identification of novel conotoxins from the Chinese tubular cone snail (Conus betulinus) by multi-transcriptome sequencing. GigaScience, 2016, 5:17.

参考文献：

[1] Gao B., et al. Cone snails: a big store of conotoxins for novel drug discovery[J]. Toxins. 2017, 9(12):397.

[2] Gao B., et al. High-throughput prediction and design of novel conopeptides for biomedical research and development[J]. BioDesign Res. 2022.

[3] 石琼, 等. 海洋芋螺资源图鉴[M], 广东：中山大学出版社, 2018.

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[5] Gurkoff G., et al. Voltage-gated calcium channel antagonists and traumatic brain injury[J]. Pharmaceuticals. 2013, 6(7):788-812.

[6] Hu H., et al. Characterization of the Conus bullatus genome and its venom-duct transcriptome. BMC Genomics. 2011, 12(60):714.

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[9] Peng C., et al. The first Conus genome assembly reveals a primary genetic central dogma of conopeptides in C. betulinus. Cell Discovery. 2021, 7(1): 11.

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[11] Peng C., et al. High-throughput identification of novel conotoxins from the Chinese tubular cone snail (Conus betulinus) by multi-transcriptome sequencing[J], GigaScience. 2016, 5:17.

[12] Gao B., et al. High throughput identification of novel conotoxins from the vermivorous oak cone snail (Conus quercinus) by transcriptome sequencing. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(12): 3901.

[13] Lu A., et al. Various conotoxin diversifications revealed by a venomic study of Conus flavidus. Mol. Cell. Proteom. 2014, 13(1):105–118.

[14] Phuong M.A., et al. Dietary breadth is positively correlated with venom complexity in cone snails. BMC Genom. 2016, 17: 401.

[15] Dutertre S., et al. Deep venomics reveals the mechanism for expanded peptide diversity in cone snail venom. Mol. Cell. Proteom. 2013, 12(2): 312–329.