秒懂SEC方法优化及色谱柱保存注意事项 |
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秒懂SEC方法优化及色谱柱保存注意事项
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分离原理 尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。 排阻色谱的固定相多为凝胶。凝胶是一种由有机分子制成的分子筛 , 其表面惰性 , 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当 , 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内 , 但进不了小孔 , 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。因此 , 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。 当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时： Xm ⇌ Xn 组分的分配系数为：
尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1 固定相 尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。 无机凝胶：又称硬质凝胶。是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。 有机凝胶：又称半硬质凝胶。如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。 流动相 尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大；能润湿凝胶，防止吸附作用。 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝胶渗透色谱）；水（凝胶过滤色谱）等。（可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等） SEC分离度 
Rs(分离度)取决于两个因素
1、α（分离系数）依赖于曲线LogM/dv的斜率
2、N 柱效
增加α的方法
1、增加总的孔体积
2、调整填料的选择范围
增加柱效（N）方法：
1、增加分离色谱柱的柱长，或几个色谱柱串联（图三）
2、降低填料的粒径
a：一根色谱柱，b：三根色谱柱串联 （图三） SEC分离色谱条件优化 影响SEC色谱分离的主要有以下5个因素 1、温度 2、流速 3、进样体积 4、样品负载 5、流动相（pH、离子浓度、离子类型） 温度：一般情况SEC分离是在常温下进行， 升高温度优点： 1）提高柱效； 2）提高分离度； 3）降低流动相粘度； 4）增加样品的溶解度（聚烯烃、聚酰胺） 流速：随着分子量增大，最优流速逐步降低 进样体积：一般色谱柱进样体积为柱体积的1% 样品负载：对于制备蛋白纯化，一般情况下10-20mg/ml。 流动相：聚合物基质：一些聚合物基质中会含有少量的羧酸，因次具有一定的 负电性。会与负电性的物质发生静电作用。抑制静电作用：增加离子强度。硅胶基质：硅胶基质中残留和可接近的硅醇基，在一定条件下硅醇基会发生解离，当pH值增大时，碱性物质会与硅胶基质发生相互作用，会增大物质的保留。酸性物质则由于表面的推动作用洗脱会比预期更早。调节流动相pH值。 色谱柱的清洗步骤 随着使用时间或进样次数的增加，出现柱效下降无法达到分离要求，或伴有峰型拖尾、分叉等情况时，就需要清洗色谱柱。建议清洗过程中将色谱柱与检测器断开连接，防止流通池污染。此类型色谱柱中的充填介质与样品间常会发生： (1) 离子相互作用； (2) 疏水相互作用等现象。 吸附的主要原因： (1)离子性吸附：分子尺寸排阻色谱柱中的树脂充填介质，由于羧基带有负电荷（尽管非常少），会与样品中带有正电荷的组分发生离子吸附作用。 (2)疏水性吸附：聚合物基质的SEC色谱柱的充填介质，会与一些疏水性较高的样品（如：具有苯环的化合物）发生疏水吸附作用。 清洗方法： 1、去除离子性杂质： 对于阳离子性吸附物质，可以通过提高盐浓度进行过柱清洗。 2、去除疏水性杂质： 对于疏水性吸附物质，可以通过提高有机溶剂的浓度进行过柱清洗。 3、去除难溶性蛋白质： 使用含尿素的溶液清洗。 请根据样品性质，从方法1和2中选择适当的清洗方法。如果色谱柱性能仍不能恢复，可考虑采用方法3。但需注意尿素可能会残留在色谱柱上。请注意：应逐渐提高流速，以免损坏色谱柱。 色谱柱的保存 • 短期保存（2-3天后还要使用） 如果数天内不会使用色谱柱，请从设备上取下色谱柱。如果溶剂中不含任何腐蚀性的离子，请使用保护塞封住色谱柱的末端。如果溶剂中含有腐蚀性离子，如卤素，请在保存之前，使用纯水清洗色谱柱。 • 长期保存（超过3天以上不用） 如果长时间不使用色谱柱，请使用纯水替换溶剂。然后请从设备上取下色谱柱，并使用保护塞封住色谱柱的末端。长期保存（例如，超过 3 个月）时，请使用含有 0.05 %叠氮化钠的水溶液保存。 |
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