拥有良好的分离度是每一个色谱工作者都梦寐以求的事情，这里我们会详细介绍分离度基本要素在方法开发过程中的重要性以及与分离方程之间关联性。相信这对新手和有经验的色谱工作者都很有用。

分离方程被认为有三个项，它们各自反映了你的方法的柱效、选择性和保留度。柱效对于在转移到较短的色谱柱时保持方法的分离度至关重要。

下面是两个GC分析色谱图。我们可以发现，较短的色谱柱对色谱柱的选择性和容量的影响可以忽略不计，在这两个色谱图中，内径（ID）和薄膜厚度保持不变。表1列出了我们应该注意的变量。

表 1 – 分离度变量

tR=保留时间

t0=“色谱柱容积”或“死体积”时间

t’=调整后的保留时间（取决于色谱柱容积）

α=选择性（两个峰的峰尖之间的关系）

k=容量因子（相对于固定相和方法条件的固有保留）

N=理论塔板（代表分析物与固定相之间的相互作用）

这两个色谱图代表了在使用新柱（长度正好是原始柱的一半）时保留时间和柱容积的比例效应。最终的效果是，我们的分离方程中的“选择性”项和“保留度”项保持不变，其数学结果如表2所示。

表2 – 选择性和保留度的对比

使用较短的色谱柱实际上会减少可用的理论塔板的数量，因为在较短的色谱柱上分析物与固定相相互作用的机会更少。这在第二张色谱图中得到了证明，尽管在洗脱过程中，这些峰仍然能保持一定的峰形，但峰与峰之间的分离度降低了。

但如果在保持相比的情况下减小内径和薄膜厚度，从而提高柱效率（N），最终可以使我们的分离度恢复到原始方法的值。较窄的内径将增加分析物与固定相之间的相互作用频率，而较薄的薄膜将增加分析物进出固定相时的传质速率。在第三张色谱图中，内径和薄膜厚度被减小，使得两个分析物的峰更尖锐，两个峰之间的分离度也就更高。

柱效（N）代表峰的尖锐度和分析物与固定相之间相互作用的机会。柱效的计算考虑了峰的宽度和峰的保留时间。早期洗脱的峰通常具有较窄的宽度，显示出其较高的柱效并可以提高该峰与相邻分析物的分离度。

一半高度（W1/2）处的峰宽即一半高度处的实际宽度

GC和LC中都有一些技巧可以在缩短色谱柱的同时保持效率。在GC（气相色谱）中，你可以保持相比的同时，减小内径和薄膜厚度，以增加分析物和固定相之间的相互作用的频率和速度。在LC （液相色谱）中，更小的颗粒增加了相互作用的频率，同时也增加了分析物进出颗粒以及相关固定相的速度。