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作者：

刘梦娟

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摘要：

电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被极大重视。虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体电荷变体的形成原因及相关机制。前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通过过氧化氢和AAPH(2,2'-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR和无细胞孵育实验显示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。本研究结果为将来调控生产过程中抗体电荷异质性的产生、提高抗体药物的产量和质量提供指导。

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关键词：

CHO细胞 碱性电荷变体 牛磺酸 氧化变体 赖氨酸变体