简单的说，自噬就是细胞自己吃自己。

没用组织都会成为溶酶体的食材，而到处为溶酶体找食材的物质就是自噬体。

自噬是由溶酶体和自噬体两部分一起参与的过程，自噬体和溶酶体结合之后，就会形成自噬溶酶体。

一、自噬的基本知识

Part.1 自噬概念

自噬(autophagy)是II型程序性细胞死亡（凋亡、铁死亡、焦亡也都属于程序性死亡）。

是指细胞利用溶酶体降解，选择性地清除自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用的正常动态生命过程。

自噬被认为是机体的一种自我保护机制。（当然自噬过度也是一种不好的行为）

Part.2 自噬种类

1）巨自噬（macroautophagy）

细胞的整个区域被包围在双膜小泡的自噬体中，这些自噬体然后与溶酶体融合成为自噬溶酶体，其内容物随后被其中的蛋白酶降解。一般情况下所说的自噬是指巨自噬。（以下说到的自噬也都指巨自噬）

2）微自噬（microautophagy)

细胞器或是内含物的囊泡直接与溶酶体相互作用并融合，微自噬比巨自噬更具特异性，可由受损细胞器表面的信号分子触发。

3）介导自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA）

也称为伴侣介导的自噬，胞质内的蛋白质通过胞质伴侣与溶酶体融合，通过分子伴侣与底物氨基酸序列内的五肽相互作用，例如底物蛋白与溶酶体LAMP-2A，并被转运到溶酶体中进行降解。

Part.3 自噬的发生过程

自噬的本质其实是细胞内的膜重排，其发生过程大体分为以下4个阶段：

自噬的起始→ 隔离膜和自噬体的形成→ 自噬体与溶酶体融合→ 自噬体的裂解

步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，有点像半球形，就像一个由2层脂双层组成的碗，会包裹住受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器。这样类似碗状的结构可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。

步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

Part.4 自噬的5个特性

①消化自身：看似对细胞不利，事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

②过程很快：被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。

③可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。批量降解：是与蛋白酶体降解途径的显著区别。

④“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。

⑤保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。

Part.5 自噬的调控

细胞基础水平的自噬活性很低，不适于观察，因此对自噬研究多需人工干预。

目前常用的自噬激动剂有Rapamycin和EBSS等，常用的自噬抑制剂有Chloroquine、3-MA、NH4Cl和 Bafilomycin A1等。

这些自噬激动剂和抑制剂可以分别激活/抑制自噬发生的不同阶段，需要根据具体研究的信号通路/物质，选择合适的激动剂或抑制剂。

Part.6 自噬相关蛋白

在自噬的发生过程中，有多种自噬相关蛋白可调节和控制自噬形成的不同阶段。

迄今为止，科学家已在酵母中鉴定出40余个编码ATG蛋白的基因，并且大多数在酵母和哺乳动物之间高度保守。在哺乳动物细胞中，饥饿诱导的自噬大约受20种核心ATG基因调节，它们在液泡附近被不断募集，并组装形成自噬前体。

这些基因的分类和作用如下：

二、自噬的检测方法

在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。

选择理想的检测方法对于自噬研究至关重要。

常用的观察和检测方法有以下：

Part.1 透射电镜检测

自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

Part.2 双荧光穿梭质粒系统检测

自噬形成时，mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。

当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。

表达mRFP-GFP-LC3的小鼠胚胎成纤维细胞（左）接受饥饿处理（2小时），其中（右）或（中）不添加100 nM巴菲霉素A1（抑制自噬小体/溶酶体融合）。中间的黄色（自噬小体）和红色（自噬溶酶体）斑点都增加了，而右边的大多数斑点都是黄色的（自噬小体）

Methods in Mammalian Autophagy Research 《Cell》doi: 10.1016/j.cell.2010.01.028

Part.3 单荧光质粒系统检测

利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；

自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

Part.4 WB检测

LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。

LC3亚型有：LC3A、LC3B和LC3C。

LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。

在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。

自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用。

WB检测虽然是自噬最经典、公认的检测方法，但是在实际课题研究中，只有WB检测证明自噬的发生还不够。有条件建议增加其它检测方法进行证明。如果实验条件不允许，可以在实验分组中增加自噬的抑制剂、自噬的激动剂做拯救实验，正反证明自噬的发生。

自噬检测方法小结：

电镜检测：观察自噬不同阶段的隔离膜，自噬小体，自噬溶酶体。

单荧光质粒检测：GFP-LC3检测。

穿梭质粒检测：通过自噬溶酶体的酸碱度改变导致的GFP淬灭来观察质粒。

WB检测：LC3. ATG family, p62(SQSTM1), Beclin 1, ULK1。

三、自噬研究思路

一篇影响因子11.2的自噬与肿瘤的文献分享：

PDIA6 modulates apoptosis and autophagy of non-small cell lung cancer cells via the MAP4K1/JNK signaling pathway 《EBioMedicine》 Yuxin Bai et al.

Part.1 现象

通过qPCR检测，IHC检测，WB检测以及临床样本检测、存活率分析得知，PDIA6蛋白在NSCLC中表达升高，它会影响到NSCLC的发生。

对PDIA6进行干扰表达：通过CCK8实验，克隆形成实验，成瘤实验以及成瘤后IHC实验发现，干扰PDIA6表达后能够明显抑制肿瘤细胞增值以及肿瘤的发生发生。

同时发现干扰PDIA6也能够促进肿瘤细胞凋亡。

Part.2 本质

干扰PDIA6能够促进细胞的自噬水平。

干扰PDIA6能够增加细胞的自噬水平，同时细胞凋亡水平也升高，但是这种现象被3-MA（自噬抑制剂）所抑制。

Part.3 机制

通过蛋白芯片检测可得知，干扰PDIA6通过JNK和c-Jun引起肿瘤细胞的自噬和凋亡，并引起p-JNK和p-c-Jun升高。

通过SP600125(JNK inhibitor)作用可发现，其能够逆转PDIA6的促进自噬和凋亡的作用。

细胞自噬相关研究资料打包分享：

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