脓毒症是指感染引起的宿主免疫失调，危及生命的器官功能障碍，是重症监护室患者死亡的主要原因之一[1-2]。肝脏是人体的重要器官，通过清除细菌、生成急性期蛋白和细胞因子以及产生适应性炎症反应，调节免疫防御[3]。脓毒症引起的全身炎症反应、免疫功能失调以及肝细胞供氧障碍，会导致急性肝功能损伤，常表现为胆红素 > 34.2 μmol/L（2 mg/dL）和国际标准化比值（international normalized ratio, INR） > 1.5的凝血障碍[4-5]。脓毒症急性肝损伤发生率约为30%，其病死率高达60%[6]。肝功能障碍会严重影响脓毒症患者的预后，是重症监护室病死率的独立预测指标[7]。因此，早期发现和及时干预脓毒症合并急性肝损伤的患者至关重要。本研究通过回顾性分析288例脓毒症患者的病历资料，对脓毒症无肝损伤与脓毒症合并肝损伤两组患者的临床资料进行比较分析，并选取部分患者外周血单个核细胞RNA进行了测序，旨在分析脓毒症急性肝损伤的流行病学特点以及致病因素，为临床脓毒症的早期预防和诊断提供依据。

选取2018年1月1日至2019年12月31日就诊于空军军医大学学第一附属医院急诊科的脓毒症患者，选取测序的患者签署知情同意书。本研究已在单位伦理委员会备案并通过审批（审批号KY20193106）。

纳入标准：①符合脓毒症3.0诊断标准[2, 8]；住院时间≥1 d；有明确感染源或细菌培养阳性证据；②脓毒症肝损伤诊断标准[4-5]：胆红素 > 34.2 μmol/L（2 mg/dL）和发生国际标准化比值（international normalized ratio, INR） > 1.5的凝血障碍。排除标准：住院时间 < 1 d；慢性肝脏疾病或者慢性肝功能障碍急性发作；药物性肝损伤；患有急慢性传染疾病；3个月内进行过放化疗；致死性创伤者。符合一项就排除。

根据是否发生脓毒症肝损伤将入组的脓毒症患者分为脓毒症肝损伤组和脓毒症无肝损伤组。根据随机数字法选取8例脓毒症肝损伤患者、4例脓毒症非肝损伤患者。提取患者外周血单个核细胞组织RNA，送广州基迪奥公司，进行文库制备工作。文库制备完成后应用Illumina HiSeqTM上机测序。

① 记录患者入科时的一般资料，包括性别、年龄、住院天数、基础疾病、入住急诊科原因、感染部位、急性生理与慢性健康状况评分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）评分、贯序器官衰竭估计（sequential organ failure assessment, SOFA）评分、是否行机械通气、致病微生物种类等；②血液学指标：炎症指标包括降钙素原（procalcitonin, PCT）、C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、白细胞介素6（interleukin, IL-6）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、白细胞计数（white blood cell, WBC）、血小板计数（platelet, PLT）；肝脏指标包括总胆红素（total bilirubin, TBil）、直接胆红素（direct bilirubin, DBil）、D2聚体、血浆纤维蛋白原（plasma fibrinogen, Fib）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase, γ-GGT）、国际标准化比率（international normalized ratio, INR）。

使用Cufflinks程序，计算出每个基因对应的表达量值，得到新的转录本。筛选条件为错误发现率（false discovery rate, FDR） < 0.05，|log2FC| > 1, 其中log2FC > 1为上调、log2FC < -1为下调。（FC：FDR与两样品组间相比的差异倍数）。

测序基因表达经过Cufflinks程序比对后，所得相对表达量使用edgeR软件统计分析。使用Excel2010和SPSS 23.0软件进行数据整理和统计分析。对于符合正态分布的计量资料以平均值±标准差(x±s)表示；对于不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（Q1，Q3）]。对患者的性别、主要诊断、首次抗生素种类等分类变量资料采用率或构成比进行描述。组间比较采用独立t检验；两组间单因素分析等计数资料的比较采用χ2检验或独立t检验。高危因素采用单因素分析方法，将单因素分析中差异有统计学意义的指标纳入Logistic回归分析，评价指标为优势比（odds ratio, OR）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

本次实验共入组288名符合Sepsis3.0的脓毒症患者，其中男性155例，女性133例；年龄（54.89±18.48）岁。脓毒症急性肝损伤患者44例，其中男性26例，女性18例；年龄（51.43±15.93）岁。与脓毒症无肝损伤组相比，肝损伤组患者高血压患病率更少、慢性肾功能不全相对更多、因肾脏疾病入住急诊科的比例更多、入院时SOFA评分、APACHEⅡ评分更高、住院天数更多（均P < 0.05）。见表 1。

脓毒症肝损伤组呼吸系统和消化系统较脓毒症无肝损伤组更易发生感染（均P < 0.05）。见表 2。

与脓毒症无肝损伤组相比，脓毒症肝损伤患者感染金黄色葡萄球菌的概率更大（P < 0.05），见表 3。

与脓毒症无肝损伤组相比，脓毒症肝损伤组中实验室指标（PCT、LDH、APTT、TBil、DBil、AST、ALT）均明显升高，而PLT、Alb较脓毒症无肝损伤组明显降低（均P < 0.05）。见表 4。

将单因素分析中差异有统计学意义的指标如APACHEⅡ评分、住院天数、是否感染金黄色葡萄球菌、PCT、LDH、APTT、TBil、DBil、AST、ALT、PCT纳入Logistic回归分析，结果发现金黄色葡萄球菌感染、PLT减少、PCT升高、LDH升高、TBil升高、ALT升高是脓毒症的独立危险因素。见表 5。

下机数据使用edgeR软件对脓毒症肝损伤组和脓毒症非肝损伤组间基因表达量进行差异分析。筛选出明显差异基因311个，与脓毒症非肝损伤组相比表达上调基因151个，下调基因160个（图 1）。

如图 2所示GO功能注释分析发现富集最为显著的前20个GO term，主要参与生物学过程、构成细胞的组分两大类别。GO富集饼状图发现，排在前10的GO term是：①血小板α颗粒、②血小板α颗粒腔、③伤口愈合、④细胞迁移、⑤多细胞有机体过程、⑥解剖结构发展、⑦软骨骨化、⑧组织发展、⑨角化、⑩多细胞生物发育。见图 3。

如图 4所示，KEGG通路富集分析发现人类疾病相关通路占主导地位，这些信号通路包括：嘌呤代谢、卟啉和叶绿素代谢、氮代谢、核黄素的代谢、FoXo信号通路、Hippo信号通路、p53信号通路。

肝脏是抵御病原微生物入侵的重要防线，在脓毒症发生发展过程中具有重要作用。脓毒症时产生细胞因子风暴和内毒素会损伤肝细胞，导致肝功能衰竭，而受损的肝细胞会释放损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs），引发更加严重的全身炎症反应，加剧肝脏和其他器官的功能障碍[9]。研究表明脓毒症引起的肝损伤是重症监护室死亡的独立预测因素[10]。本研究发现，与脓毒症非肝损伤患者相比，脓毒症肝损伤患者入院APACHEⅡ评分更高，住院天数更多，表明合并肝损伤患者病情更严重；病死率更高，说明合并肝损伤患者预后不良。

促炎反应是脓毒症的关键状态，肝脏在炎症中起重要作用。脓毒症过程中细菌及其产物（如脂多糖）通过肝动脉和门静脉到达肝脏。肝库普弗细胞产生大量的炎症因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）和趋化因子（CCL2），并激活其他免疫细胞（中性粒细胞和单核细胞），形成细胞因子风暴。本研究发现，与脓毒症无肝损伤组相比，脓毒症肝损伤组中炎症因子（IL-6、PCT、LDH）明显升高，表明脓毒症肝损伤患者的炎症反应更加严重。

脓毒症通常伴随着血小板的活化，在止血过程中发挥着关键作用。越来越多的研究发现血小板在炎症反应中起着不可或缺的作用[11]，持续性血小板减少被认为是脓毒症患者死亡的独立危险因素[12]。本研究发现，与脓毒症非肝损伤患者相比，脓毒症肝损伤患者凝血指标（GGT、APTT）明显升高，PLT明显减少，表明脓毒症肝损伤患者处于高凝状态，使脓毒症持续进展，最终导致难治性休克，多脏器功能衰竭甚至死亡。这与测序结果一致，脓毒症发病过程中血小板α颗粒和血小板α颗粒腔发挥重要作用，因此脓毒症肝损伤患者血小板明显减少，机体病原体清除能力下降，组织的修复和血管重构能力也受到严重的影响，最终导致肝脏甚至多脏器功能衰竭，对患者的预后产生不良影响。

KEGG通路富集分析发现FoXo信号通路、Hippo信号通路、p53信号通路与脓毒症肝损伤的发病机制密切相关，基因本体显示蛋白质目标主要参与细胞的增殖与凋亡。FOXO转录因子是人体内重要的转录因子叉头蛋白家族，参与许多细胞生理过程，如细胞凋亡、细胞周期调控、葡萄糖代谢、抗氧化应激等[13]。Hippo信号通路由一系列保守激酶组成，主要通过调控细胞增殖和凋亡来控制器官的大小，保持肝脏的稳态[14]。P53是一个抑癌基因，参与细胞凋亡、生长抑制、分化和加速DNA修复等，对肝脏的损伤修复具有重要作用[15]。大量研究表明细胞凋亡参与了脓毒症对器官组织的损伤并增加了临床的病死率[16-17]。肝细胞凋亡是脓毒症合并肝损伤的中心环节。最新的研究发现抑制肝细胞凋亡可以减轻脓毒症肝损伤，提高患者的预后[18-19]。

在美国，金黄色葡萄球菌感染是社区发生脓毒症的主要原因之一[20]。正常情况下，金黄色葡萄球菌进入人体血液后，大部分被肝脏库普弗细胞吞噬清除，小部分被肝脏中循环的中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬。如果这些宿主细胞不能杀死细菌，细菌就会在细胞内增殖，扩散到全身，引起脓毒症[21-22]。本研究发现，与脓毒症非肝损伤组相比，脓毒症肝损伤患者更易患金黄色葡萄球菌感染，表明肝脏在清除病原微生物方面具有重要作用。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  张锦鑫、沈括：设计实验、实施研究、采集数据、分析数据、后期图标制作、文章撰写等；李俊杰：文章修改、统计分析、对文章的知识性内容作批判性审阅；尹文：工作支持，获取研究经费，行政、技术或材料支持和指导。