我国荒漠带主要分布于内蒙古、 甘肃、 宁夏、 新疆等西北地区，气候条件恶劣，植物种类组成与群落结构简单，生态系统极其脆弱，生态环境易受破坏. 蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)隶属豆科沙冬青属，具有极强的抗逆性，是荒漠地区主要防风固沙的优良灌木和珍稀濒危植物，对于荒漠生态系统维持和沙漠绿化有重要作用. 但是，目前沙冬青天然种群的退化导致其分布面积日趋减小而处于濒危状态.

微生物是整个土壤生态系统的重要部分，推动着生态系统物质能量的循环和转化，对生态系统功能维持起关键作用[1]. 土壤微生物群落结构和多样性能较早反映土壤环境质量的变化，揭示微生物功能差异性，已被认为是重要的生物学指标[2]. 磷脂脂肪酸(PLFA)是一种可定性和定量分析土壤微生物群落多样性的方法，根据不同微生物体PLFA组成和含量的种属特异性，对微生物生物量及其群落结构进行估算. 目前PLFA已广泛应用于不同土壤类型微生物的研究[3]，Tunlid等[4]认为土壤中PLFA的组成可直接表示土壤微生物群落的生物量和结构，近年来利用PLFA方法对土壤微生物群落结构的研究已取得大量成果[5, 6].

土壤微生物作为植物与土壤互作的重要成分，其群落组成除受特殊气候和地理环境影响外，地表植被覆盖类型对土壤微生物的结构和组成有直接影响[7]. 李晶等[8]对土壤微生物环境胁迫响应机制的研究表明，土壤微生物对所生存的土壤坏境十分敏感，土壤生态机制变化和环境胁迫都能导致微生物群落结构的改变，进而影响地上植被的生长状况. Fierer等[9]研究认为土壤微生物群落结构具有一定的空间分布特征，土壤通气性、 水分状况、 养分状况等对土壤微生物群落结构的空间分布均有重要影响. 因此，对沙冬青根围土壤微生物群落的研究，有利于更好地理解沙冬青的抗逆机制. 此外，探究AM真菌在生态系统中的功能已经成为菌根学领域新的研究热点，其根外菌丝分泌物可影响不同微生物类群活跃程度，改变土壤微生物群落结构[10]. 杜小刚等[11]研究表明，AM真菌对刺槐根际微生物群落的稳定和功能多样性的增加都具有促进作用.

目前，国内外对沙冬青的研究主要集中在沙冬青内生真菌分布、 物种多样性及生态功能等方面[12, 13]，而对沙冬青根围土壤微生物群落结构的研究甚少. 本试验采用磷脂脂肪酸法结合Sherlock微生物鉴定系统，研究蒙古沙冬青根围土壤微生物群落结构空间分布和AM真菌对荒漠土壤微生物群落的影响，深入探讨土壤因子对微生物分布的影响，以期为干旱风沙区荒漠植被恢复和生态环境保护提供依据.

于2015年7月在内蒙古乌海、 磴口、 阿拉善分别选取3个小样地，各小样地分别随机选取生长良好的3株蒙古沙冬青植株，去除土壤表层枯枝落叶层后，在距植株主干0~30cm范围内采集土壤样品，将土样装入隔热性能良好的采样袋中保存并带回实验室过2 mm筛. 部分土样保存在-20℃用于PLFA检测(0~30 cm)和土壤酶活性测定(0~50 cm)，其余土样进行土壤理化性质分析(0~50 cm). 各采样点概况如表 1所示.

土壤pH用精密酸度计测定； 土壤有机C用马弗炉烘干法； 氨氮按碱解法并利用全自动化学分析仪Smartchem200测定； 有效P用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法[14]测定； 速效K用1 mol·L-1醋酸铵浸提-火焰光度法测定. 用改进的Bremner和Tabatabai法[15]测定土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，活性分别以每克土样培养1 h酸性磷酸酶和碱性磷酸酶转化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的量(μg·g-1)表示. 土壤脲酶用改进的Hoffmann与Teicher比色法[16]测定，活性以每克土样培养1 h催化尿素分解产生NH3-N的微克数(μg)表示.

土壤球囊霉素分别按Wright等[17]和Janos等[18]方法测定. 易提取球囊霉素(EEG)： 取1 g土样于试管中，加入8 mL、 20 mmol·L-1(pH 7.0) 的柠檬酸钠浸提剂，在103 kPa、 121℃条件下连续提取90 min，10000 r·min-1离心5min，收集上清液； 总球囊霉素(TEG)： 取1 g风干土于试管中，加入8 mL、 50 mmol·L-1(pH 8.0) 柠檬酸钠浸提剂，在103 kPa、 121℃条件下连续提取60 min，再重复提取2次； 10000 r·min-1离心5 min，收集上清液. 分别吸取上清液0.5 mL加入5 mL考马斯亮蓝G-250染色剂，在595 nm波长下比色. 用牛血清蛋白标液，考马斯亮蓝法显色，绘制标准曲线，求出球囊霉素含量.

土壤微生物群落结构通过分析土壤中微生物磷脂脂肪酸组分来测定，根据Bossio等的方法有所改进[19].

(1) 提取分离 称取8.0 g冻干土样，使用单相提取剂柠檬酸缓冲溶液[氯仿∶甲醇∶柠檬酸比为1∶2∶0.8(体积比)]浸提(剩余土壤用提取液重复浸提一次)，浸提液倒入分液漏斗，分别加入12 mL三氯甲烷和磷酸缓冲液，摇动2 min，静置过夜.

(2) 纯化 用SPE柱(3 mL氯仿活化)分离，分别加入5 mL氯仿、 10 mL丙酮，最后用5 mL甲醇淋洗，收集甲醇相于试管中，32℃水浴，N2浓缩.

(3) 甲酯化 向试管中依次加入1 mL 1∶1甲苯∶甲醇和0.2 mol·L-1 KOH溶液摇匀，37℃下温育1 h，依次加入0.3 mL 1 mol·L-1醋酸溶液，2 mL正己烷和2 mL超纯水，低速振荡10 min(重复振荡浸提一次)，将上层正己烷溶液移入小瓶，N2脱水干燥，得到甲酯化脂肪酸样品. 该样品用200 μL正己烷溶解，在气相色谱仪(美国Agilent6890N型)上采用MIDI软件系统(MINDI,Newark,Delaware,USA)结合SherlockMIS4.5系统(Sherlock Microbial Identification System)进行磷脂脂肪酸鉴定分析.

磷脂脂肪酸命名参考Frostagard等[20]的命名方法. 每种脂肪酸通过单个样品中的内标(C19:0,10 ng·μL-1)来表达定量(nmol·g-1)，按照Abaye等[21]描述的方法计算PLFA含量，计算公式为：

式中，PFAME和PISTD分别是每个甲酯化脂肪酸和内标峰面积，cng,std是内标浓度(ng·μL-1)，Mng,std是内标摩尔质量，V(μL)代表溶样体积，W(g)代表干重土壤质量.

细菌特征PLFAs包含12:0 anteiso、 13:0 anteiso、 14:0、 15:0 anteiso、 15:0 iso、 15:0、 16:0 anteiso、 16:1ω7c、 16:0、 17:1 iso ω9c、 17:0 anteiso、 17:0 iso、 17:1ω8c、 17:0 cyclo ω7c、 18:1ω7c、 18:1ω5c、 19:0 cycloω7c，其中12:0 anteiso、 13:0 anteiso、 14:0、 15:0 anteiso、 15:0 iso、 15:0、 16:0 anteiso、 17:0 iso、 17:0 anteiso和17:1 iso ω9c划分为革兰氏阳性细菌(G+)，而16:0、 16:1ω7c、 17:1ω8c、 17:0 cyclo ω7c、 18:1ω7c、 18:1ω5c和19:0 cyclo ω7c归为革兰氏阴性细菌(G-). 18:0 10-methyl、 16:0 10-methyl和20:0 10-methyl表征放线菌； 18:1ω9c和18:2ω6c表征真菌； 16:1ω5c表征AM真菌.

所有试验数据取3个重复的平均值，用EXCEL 2003软件整理，利用SPSS 19.0生物统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA). 采用CANOCO 4.5软件对土壤因子进行主成分分析(PCA)，土壤因子与微生物群落的相关性进行RDA分析.

3个样地土壤pH均呈碱性，磴口和阿拉善各土层pH差异不显著，乌海各土层pH均高于乌海和磴口，随土层加深pH增大，但差异不显著(表 2). 同一样地不同土层，土壤脲酶在乌海最大值出现在0~20 cm土层，并随土层增加逐渐降低； 磴口和阿拉善样地脲酶在各土层变化规律不显著. 不同样地同一土层，乌海脲酶在0~20 cm高于磴口和阿拉善； 20~50 cm各土层样地间差异不显著.

同一样地不同土层，乌海和阿拉善磷酸酶在0~10 cm有最大值，并随土层增加呈降低趋势； 磴口最大值在0~20 cm土层，并逐渐下降(除40~50 cm土层). 易提取球囊霉素在乌海最大值出现在0~10 cm，各土层变化规律不明显； 磴口和阿拉善易提取球囊霉素在0~20 cm土层有最大值，并随土层深度增加呈降低趋势. 3样地总球囊霉素最大值都在0~10 cm土层，并随土层增加呈下降趋势. 不同样地同一土层，阿拉善磷酸酶在0~50 cm各土层都显著高于乌海和磴口. 乌海和阿拉善易提取球囊霉素在0~50 cm各土层都显著高于磴口. 3样地总球囊霉素在0~10 cm土层差异不显著，20~50 cm各土层均表现为阿拉善＞乌海＞磴口.

同一样地不同土层，土壤有机C在乌海和阿拉善最大值都在0~20 cm土层，并随土层增加呈降低趋势； 磴口土壤有机碳各土层差异不显著. 乌海氨氮在0~10 cm土层有最大值，并随土层增加呈降低趋势； 磴口氨氮各土层变化规律不明显； 阿拉善氨氮最大值在0~30 cm土层. 有效P在乌海各土层变化规律不明显； 磴口和阿拉善最大值在0~10 cm土层，并随土层增加呈降低趋势. 速效K最大值都出现在0~20 cm土层，乌海呈下降趋势. 不同样地同一土层，有机C在0~30 cm表现为乌海＞阿拉善＞磴口； 阿拉善0~30 cm氨氮显著高于乌海和磴口； 磴口0~50 cm各土层有效P显著高于乌海和阿拉善； 磴口0~20 cm土层速效K高于乌海和阿拉善，20~50 cm各土层阿拉善速效钾显著低于乌海和磴口.

从内蒙古乌海、 磴口和阿拉善3样地土壤样品中分别检测到41、 31和48种磷脂脂肪酸，选取大于0.01nmol·g-1的28种PLFA生物标记进行分析(表 3). 根据周赛等[22]微生物空间分布研究，不同地点土壤微生物差异显著. 有些PLFA生物标记在3样地都有属完全分布，如16:0、 16:1ω7c、 16:1ω5c、 18:2ω6c、 18:1ω9c、 16:0 10-methy1和19:0 cyclo ω7c等； 有些生物标记只在单个样地分布，如12:0 anteiso、 14:0、 15:0、 15:0 DMA、 16:3ω6c、 17:0 iso、 18:1ω5c和19:3ω6c，属不完全分布.

3样地土壤中含量最高的PLFA生物标记是16:0(指示革兰氏阴性细菌)，16:0 10-methy1(指示放线菌)，18:1ω9c(指示真菌)和16:1ω7c(指示革兰氏阴性细菌)，说明在不同样地土壤起主要作用，4种PLFA生物标记含量在不同样地差异显著，但都表现为磴口最低. 从磷脂脂肪酸变化看，乌海样地中的16:0、 16:0 10-methy1、 18:1ω9c和16:1ω7c等4种PLFA含量分别为0.096、 0.071、 0.067和0.066 nmol·g-1，占总脂肪酸含量38%； 以16:0、 16:0 10-methy1、 18:1ω9c和16:1ω7c PLFA生物标记为主的磷脂脂肪酸含量在磴口样地占总脂肪酸36%，分别为0.056、 0.040、 0.039和0.056 nmol·g-1. 阿拉善样地，含量较高的为16:0、 16:0 10-methy1、 18:1ω9c和16:1ω7c，占总脂肪酸32%，分别为0.055、 0.064、 0.077和0.110 nmol·g-1. 总体而言，不同样地，含量较高的脂肪酸结构种类基本相同，但PLFA生物标记含量在各样地分布差异显著，说明蒙古沙冬青根围土壤微生物磷脂脂肪酸具有空间分布特征.

不同样地土壤微生物群落主成分分析(图 1)表明，与土壤微生物PLFA群落多样性相关的2个主成分累计贡献率达到99.6%，其中，第1主成分(PC1) 和第2主成分(PC2) 分别解释变量方差的96.8%和2.8%. 对主成分1起主要作用的微生物PLFA有8个，其中16:1ω7c和17:0 cycloω7c与PC1正相关，12:0 anteiso、 14:0、 15:0、 13:0 anteiso、 18:1ω5c和19:3ω6c与PC1负相关； 对主成分2起主要作用的微生物PLFA有20:4ω6c、 20:0 10-methyl、 16:3ω6c、 16:0 iso、 15:0 DMA、 16:0 10-methyl、 18:0 10-methy、 17:0 iso、 16:0、 17:0 anteiso、 18:2ω6c和18:1ω9c，其中20:4ω6c、 20:0 10-methyl和16:3ω6c与PC2负相关. 3样地被明显区分开，乌海样地位于主成分1和2的正端，磴口样地位于主成分1和2的负端，阿拉善样地位于主成分1的负端，主成分2的正端. 由此可见，16:1ω7c、 17:0 cycloω7c、 16:0 iso、 15:0 DMA、 16:0 10-methyl、 18:0 10-methy、 17:0 iso、 16:0、 17:0 anteiso、 18:2ω6c和18:1ω9c是影响沙冬青根围土壤微生物的主要PLFA.

由表 4可知，各微生物类群PLFA总量在3样地表现为G+＞G-＞放线菌＞真菌＞AM真菌. 不同样地，革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌和真菌均表现为阿拉善含量最高，磴口最低，放线菌PLFA总含量表现为乌海＞阿拉善＞磴口. G+/G-大小排序为阿拉善＞磴口＞乌海，真菌与细菌比值大小排序为乌海＞阿拉善＞磴口. 各样地经纬度不同导致到达地面的太阳辐射不均匀，微生物热量条件及自然地理位置的差异使得土壤微生物呈现出显著空间分布特征.

对土壤因子各指标进行PCA排序(图 2)，两个排序轴对物种变量的解释量达86.1%,可将其作为主成分轴. 其中，第1主成分(PC1) 可解释变量方差的54.8%，酸碱磷酸酶(ACP和ALP)、 EEG、 TEG、 脲酶(U)和氨氮对PC1贡献最大； 第2主成分(PC2) 可解释变量方差的31.3%，速效K对PC2起主要作用. 由图 2可知，有机C和速效K是乌海样地的主要影响因子，速效K和有效P是磴口样地的主要影响因子，pH，ALP和氨氮是阿拉善样地的主要影响因子. 因此，土壤有机C、 ACP、 ALP、 EEG、 TEG、 脲酶、 氨氮和有效P能综合反映内蒙古荒漠带土壤营养状况.

利用RDA对微生物群落多样性与土壤因子(0~30 cm平均值)的相关性进行分析(图 3)，两个排序轴解释量达99.1%，其中，第1主成分(PC1) 可解释变量方差的87.5%，第2主成分(PC2) 可解释变量方差的11.6%. 由图 3可知，AM真菌与酸性磷酸酶和碱性磷酸酶显著正相关，与有效P和速效K显著负相关； 革兰氏阳性菌与磷酸酶和氨氮显著正相关，与速效K显著负相关； 革兰氏阴性菌、 真菌和放线菌均与磷酸酶和总球囊霉素显著正相关，与有效P和速效K显著负相关. 革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的比值与有效P显著正相关，与脲酶，有机C和易提取球囊霉显著负相关； 真菌与细菌的比值与易提取球囊霉素，脲酶和有机C呈显著正相关，与有效P和速效K显著负相关.

由表 5可知，在土壤真菌生物量中，AM真菌所占比重很大，尤其在磴口和阿拉善AM真菌占到真菌生物量91%和92%，在乌海为69%. 乌海真菌/总微生物量为0.039，而AM真菌/总微生物量为0.027. 在磴口和阿拉善，真菌/总微生物量与AM真菌/总微生物量分别为0.027和0.025、 0.041和0.037，没有显著差异. 样地间，磴口真菌/总微生物量显著低于乌海和阿拉善，阿拉善AM真菌/总微生物量显著高于乌海和磴口.

磷酸脂肪酸生物标记的总含量能够基本反映土壤微生物总量，本研究应用PLFA法从内蒙古乌海、 磴口和阿拉善样地土壤样品中分别检测到41、 31和48种磷脂脂肪酸，与农田和森林生态系统[23~24]土壤相比，蒙古沙冬青根围土壤微生物PLFA种类丰富，但PLFA相对含量较低，说明荒漠干旱盐碱环境对微生物生长有一定抑制作用，与Yuan等[25]研究结果相似. 蒙古沙冬青根围土壤中含量较高的脂肪酸结构种类基本相同，均以16:0、 18:1ω9c、 18:2ω6c和16:0 10-methy1为主. 18:1ω9c和18:2ω6c是真菌PLFA的主要生物标记，Bardgett等[26]的研究表明真菌比细菌更能适应养分贫瘠环境，本试验3样地表征真菌的18:1ω9c和18:2ω6c的分布量较大，说明真菌对沙冬青在荒漠干旱环境的生长起重要作用.

有关研究表明，不同样地导致土壤温度、 水分、 养分、 有机质分解甚至微生物活性等一系列因子的改变，显著影响土壤微生物群落结构[27]. 本研究中，蒙古沙冬青根围土壤微生物群落结构在不同样地差异显著，但对养分缺乏环境耐受力强的革兰氏阳性细菌[28]在3样地最高，表现出对荒漠干旱环境的适应性. AM真菌、 革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、 真菌及放线菌均在磴口最低，可能是由于磴口位于乌兰布和沙漠附近，属移动沙丘，受风蚀作用更强，不利于微生物生长繁殖，加之高温作用使得有机质分解加快，有机质的减少使微生物多样性降低； 本试验结果显示磴口有机C含量最低，真/细菌作为表征土壤有机质的指标，也在磴口有最小值，从侧面反映了磴口土壤质量贫瘠. AM真菌、 革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌和真菌表现为阿拉善＞乌海，而放线菌PLFA总含量表现为乌海＞阿拉善. 有研究表明[29]，大多数真菌为好氧性，细菌喜欢在相对湿润和中性偏碱土壤环境中生长，受水分和干旱胁迫明显，而放线菌喜热耐干，对干燥和碱性条件抗性较大. 乌海较阿拉善相比，气候干旱，pH高于阿拉善，因此干旱和碱性环境使得放线菌含量在乌海大于阿拉善； 阿拉善样地的沙冬青较其他样地根系发达，入土更深，加之真菌与沙冬青根系间土壤养分的迁移，形成分泌物等会进一步改善土壤环境，使得细菌和真菌在阿拉善较丰富.

丛枝菌根的生态功能不仅局限于促进植物营养吸收，其菌丝在土壤内延伸，对整个土壤系统及微生物群落都会产生影响[30]. 在真菌生物量中，AM真菌所占微生物量最大[31]，乌海AM真菌占到真菌生物量的一半以上，磴口和阿拉善AM真菌占到真菌生物量的91%和92%，真菌/总微生物量与AM真菌/总微生物量没有显著差异. 可见，AM真菌是荒漠土壤微生物系统中重要组成成分. 研究表明，在土壤生态系统中，AM真菌根外菌丝可向土壤微生物群落分泌、 传递营养物质，其广泛延伸的菌丝体网还可影响土壤内部气体和水分状况，从而影响不同微生物类群的活跃程度，改变微生物的群落结构[10]. 另外，作为植物与土壤微生物能量传递的媒介，AM真菌可将含丰富能量的光合产物通过其菌丝体以渗出液的形式传入土壤[32]； 反过来，AM真菌与土壤其它微生物类群一起形成协同作用，也会抑制植物病源真菌生长，从而促进宿主植物生长[33]. 由此可见，AM真菌对荒漠植被生长及生态系统稳定有重要作用.

土壤受多种成土因素综合影响，荒漠土壤更复杂，土壤微生物特性在空间变异性相对较大. 土壤微生物群落结构主要指土壤中各主要微生物类群(包括细菌、 真菌、 放线菌等)在土壤中的数量以及各类群所占比率，其分布与土壤性质和植被等环境因子密切相关. 本研究中，AM真菌、 革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、 真菌和放线菌均与磷酸酶、 总球囊霉素、 氨氮和pH正相关. 沙冬青与AM真菌能够形成良好共生关系，AM真菌能够分泌球囊霉素和酸性磷酸酶，球囊霉素是由AM真菌分泌产生的具有一定黏附力的糖蛋白[34]，是有机碳库最重要的来源； 磷酸酶在土壤生态系统中参与物质和能量代谢，能够为土壤微生物生命活动提供所需养分和能量[35]； 氨氮也是土壤肥力的主要来源，土壤越肥沃，微生物量越大. G+/G-与脲酶、 有机碳和易提取囊霉显著负相关，而真/细菌与易提取球囊霉素、 脲酶和有机碳显著正相关. G+/G-值高说明土壤状况由贫瘠转向丰富，有机碳和易提取球囊霉越低，土壤营养状况贫乏，G+/G-越大； 而在碱性环境中，真/细菌比值高，土壤环境质量改善,微生物类群丰富度较高，数量愈趋平衡[36].

(1) 蒙古沙冬青根围土壤微生物PLFA有较高多样性，共检测到41、 31和48种磷脂脂肪酸，16:0、 16:0 10-methy1、 18:1ω9c和16:1ω7c为土壤优势PLFA，且16:0(表征细菌)含量最大.

(2) 蒙古沙冬青根围土壤微生物群落结构有明显空间分布特征，土壤微生物以革兰氏阳性细菌(G+)为主. AM真菌、 革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌(G-)和真菌表现为阿拉善＞乌海＞磴口，而放线菌PLFA总含量表现为乌海＞阿拉善＞磴口，且AM真菌在土壤真菌生物量中所占比重最大.

(3) ACP、 ALP、 EEG、 TEG、 有机C、 氨氮和有效P能综合反映土壤肥力状况. AM真菌、 革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、 真菌和放线菌与土壤ACP、 ALP、 TEG、 氨氮和pH正相关. G+/G-与脲酶、 有机C和EEG显著负相关，而真/细菌与EEG、 脲酶和有机C显著正相关.

(4) 基于荒漠土壤微生物生长特性，选育在干旱环境迅速繁殖的有益微生物，应用生物技术改善荒漠土壤生态环境，对于干旱风沙区荒漠植被恢复和生态环境保护有重要意义.

感谢河北大学生命科学学院胡从从、 王坤同学协助野外样品采集工作.