唐开永，周鸿翔*，田娅玲，邹聪丽

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

摘 要：采用考马斯亮蓝法、双缩脲法及紫外分光光度法对还原型谷胱甘肽含量测定进行比较研究，结果表明，紫外分光光度法对还原型谷胱甘肽的测定结果较考马斯亮蓝法和双缩脲法均要好。通过紫外分光光度法进行稳定性、精密度、重现性及回收率试验，结果显示，4个验证试验的相对标准偏差均小于5%。通过乙酸、乙醇和NaCl 3种干扰物试验分析，研究发现：乙酸对还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量测定结果影响较大，其次是乙醇，而NaCl对还原型GSH含量无影响，表明酸和醇类物质均会影响紫外分光光度计法对低浓度小分子多肽含量测定结果。

关键词：小分子多肽；考马斯亮蓝法；双缩脲法；紫外分光光度计法

小分子多肽（小肽）是介于氨基酸与蛋白质之间的一种生化物质，具有结构简单、消化吸收利用率好、功能速度快、促进机体物质代谢、毒性较小、免疫原性好等优点，是当前医学界、生物学界、功能性食品开发及食品保健等领域研究的一大热点[1]。小分子多肽的制备常由组织蛋白质通过酶水解，再经离心、超滤膜过滤、柱层析等一系列步骤完成，其中间产品多为低浓度小肽溶液，在分离纯化过程中必须有一种可以快速检测低浓度小肽含量的方法即时反映分离效果[2-3]。

由于小肽是蛋白质的低分子组成成分，其含量的测定可以参考蛋白质含量的测定方法。蛋白质含量测定的常规方法主要有凯氏定氮法（Kjeldahl determination，KD）[4]、考马斯亮蓝（Bradford）染色法[5]、双缩脲比色法（biuret assay，BA）[6]、Folin-酚试剂法（Lowry）[7]、紫外分光光度法（ultraviolet-spectrophotometric，UV-S）[8]等，这些方法均有其各自的特点及适用条件。Kusunoki等[9]用Lowry法测定疫苗中蛋白的含量，通过方法改进，避免干扰物质的影响，可以检测疫苗中低浓度的蛋白质含量。姬玉梅[10]利用凯氏定氮法、近红外透射光谱分析法和考马斯亮蓝染色法分别对14个小麦品种进行蛋白质含量的测定，结果发现，3种方法对小麦蛋白质测定结果无显著差异。刘世清等[11]利用4种方法对动物血清蛋白质进行测定，结果表明，双缩脲试剂法对动物血清蛋白的测定效果较好。Pavel等[12]通过KD、Lowry和Bradford对蜂蜜中蛋白质含量进行了测定研究，结果表明3种方法均可以检测蜂蜜中蛋白质含量，但Bradford测定效果更准确可靠。贾维宝等[13]对肽粉中蛋白质含量测定方法进行了比较研究，结果表明，用双缩脲法测定的肽粉中蛋白质含量结果准确，且操作简单。苏冰等[14]用UV-S测定血红素多肽含量时发现，在 2 μg/mL～10 μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）。Sapan等[15]综述6种蛋白质和多肽含量检测方法的研究进展，KD法较其他检测方法的灵敏度低，而很少被应用；BA测量结果准确性高，是测量蛋白质的首选，但是研究发现，双缩脲法在0.5 mg/mL～4.0 mg/mL范围内呈线性；UV-S的灵敏度取决于蛋白质的吸光度；Bradford法是最常用且易操作的一种，但是蛋白质的浓度影响其准确性，其线性范围在20 μg/mL～500 μg/mL；其实 Lowry灵敏度比 BA 高，但是很多物质的存在都会干扰蛋白质的测定；二辛可宁酸法（bicinchoninic acid，BCA）比 Lowry法的测定更复杂，且测量值受很多成分的干扰。综上所述，关于蛋白质的检测研究从未停止，但是以上主要是关于总蛋白量、肽粉中蛋白总量及聚肽含量的测定，均不是对低浓度小分子多肽含量测量的研究。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成，且含有巯基的三肽，是典型的小肽物质。目前为止，关于低浓度小肽含量测定方法的研究报道很少，本研究基于还原型谷胱甘肽为分析材料，用Bradford、BA及UV-S 3种方法对不同浓度的还原型谷胱甘肽含量测定进行比较研究，旨在探索能够方便、快捷、准确、稳定的测定方法，为低浓度小肽含量的测定提供理论基础。

1.1.1 试验试剂

硫酸铜（CuSO4）：天津市福晨化学试剂厂；酒石酸钾钠氯化钠：成都金山化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛血清蛋白：生工生物工程（上海）有限公司；考马斯亮蓝G250、还原型谷胱甘肽（GSH）：北京索莱科技有限公司；95%乙醇、85%磷酸、冰乙酸、无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司，以上均为分析纯。

1.1.2 试验设备

CP-214电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；101-1型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；721可见分光光度计：上海洪纪仪器设备有限公司；紫外可见分光光度计UV-2550：日本岛津制作所。

1.2.1 低浓度小肽含量检测方法

考马斯亮蓝法、双缩脲法及紫外分光度法的溶液配制及标准曲线绘制方法及步骤均参照《生物化学实验原理和方法》[16]蛋白质化学部分的蛋白质含量测定的介绍。其中标准曲线的试验试剂均采用还原型谷胱甘肽标准品。

1.2.1.1 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝溶液的配制参照文献[16]；溶液配制好置于暗处避光待用。

标准曲线的绘制，以还原型GSH浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。其操作参考文献[16]并稍作改进：配制 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL 9 个梯度浓度的GSH溶液，分别取5 mL考马斯亮蓝溶液加入装有1 mL上述浓度样品的刻度比色试管中，在595 nm波长下测定其吸光度值，用95%乙醇洗涤比色皿去色。

1.2.1.2 双缩脲法

双缩脲溶液的配制参照文献[16]。

绘制标准曲线：以还原型GSH浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。其操作参考文献[16]并稍作改进：加入 1 mL 浓度为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的GSH标准溶液并作标号，分别向7支刻度比色试管加入4 mL双缩脲溶液，室温静置30 min，在540 nm下测定并且记录吸光度值。

1.2.1.3 紫外分光度法

标准曲线的绘制，以还原型GSH浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。梯度浓度分别为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的GSH溶液，在238 nm波长下测定其吸光度值[17]。

1.2.2 检测方法的验证试验

对UV-S做稳定性、精密度及重现性、回收率、干扰物验证试验。

1.2.3 试验数据分析

数据以±s表示，用 IBM SPSS Statistics 20.0 软件进行方差分析，以R2＞0.99判断线性相关性，P＜0.05作为差异显著性的依据。

2.1.1 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法对不同浓度还原型GSH标准溶液吸光度值的分析，如图1所示。

图1 考马斯亮蓝法测定不同浓度GSH含量Fig.1 The determination of GSH in different concentrations by coomassie brilliant blue method

结果表明：GSH浓度与对应吸光度值不成线性关系，R2为0.71，P＞0.05，这可能是由于小分子多肽蛋白不能与考马斯亮蓝溶液结合显色[18]，从而浓度与吸光度值不能拟合线性[19]。因此，考马斯亮蓝法不适合测定小分子多肽含量。

2.1.2 双缩脲法

在540 nm的波长下，通过双缩脲法对不同浓度还原型GSH含量测定的标准曲线如图2。

图2结果显示：较高浓度范围内，GSH浓度与吸光度值呈现线性关系，拟合线性R2=0.993 2，P＜0.05，其线性回归方程：Y=0.169x+0.037；陈西娟[20]用双缩脲法测定白果多肽时，其多肽含量较大，与吸光度值呈线性关系，这与本研究相符合；但是低于0.1 mg/mL的低浓度测定时，GSH的吸光光度值与浓度线性关系不显著，R2=0.85（P＞0.05），甚至出现负值，结果表明：双缩脲法不适合测定低浓度小分子多肽的含量。

2.1.3 紫外分光光度法

在238 nm波长下，不同浓度还原型GSH吸光度值如图3。

图2 基于双缩脲法对不同浓度还原型GSH含量测定结果Fig.2 The determination of GSH content of different concentration by biuret method

图3 紫外分光光度法的标准曲线Fig.3 UV-spectrophotometry standard curve

还原型GSH的吸光光度值与浓度呈显著线性关系，拟合线性R2=0.999 4，P＜0.05，其线性方程：Y=0.297 2x+0.086 3，Kaur等[21]对聚肽低浓度蛋白质含量进行了测定研究，与本研究结果基本一致，由此表明：紫外分光光度计法适合低浓度小分子多肽的测定。

2.2.1 稳定性试验

通过紫外分光光度法对0.1 mg/mL的还原型GSH溶液每8小时检测一次，进行48 h的稳定性试验测定（图4）。

结果发现，在48 h内0.1 mg/mL的还原型GSH溶液的吸光度值非常稳定，相对标准偏差RSD为0.742%（小于5%），表明紫外分光光度法测定小分子多肽蛋白稳定性较好。

2.2.2 精密度及重现性试验

运用UV-S对0.1mg/mL的还原型GSH标准溶液精密度和重现性试验，用一个样品重复6次检测测其精密度，其吸光度值见图4；6个样品分别测定验证方法的重复性，其吸光度值见图5。

6次检测结果的吸光度值均表现平稳，未出现较大幅度的波动，且RSD分别为0.660%和1.051%（均小于5%），表明紫外分光光度法测定小分子多肽蛋白的精密度高且重现性好。

图4 稳定性试验Fig.4 Stability test

图5 精密度及重现性试验Fig.5 The test of precision and reproducibility

2.2.3 回收率试验

通过紫外分光光度法，取4 mL 0.1 mg/mL的还原型GSH溶液分别加入1 mL不同浓度的还原型GSH溶液中进行回收率（回收率=实际浓度/标准浓度）试验研究（具体见表1）。

表1 回收率试验Table 1 Recovery test

编号标准浓度/（mg/mL）吸光度实际浓度/（mg/mL）回收率/%1 0.05 0.102 0.053 106.00 2 0.10 0.115 0.097 97.00 3 0.15 0.133 0.157 104.68 4 0.20 0.145 0.198 99.00 5 0.25 0.162 0.255 102.00 6 0.30 0.176 0.302 100.68

6个不同浓度的还原型GSH的回收率为97%～106%，且RSD为3.345%，表明紫外分光光度法测定小分子多肽蛋白回收率较好。

2.2.4 干扰物试验

在相同还原型GSH浓度的情况下，分别添加5种不同体积分数的乙酸、无水乙醇和1 mol/mL NaCl三种物质进行干扰物试验分析（图6）。

图6 干扰物试验Fig.6 Interference test

结果发现，当添加不同体积分数的乙酸时，吸光度值随溶液中乙酸体积分数的增大而增加。当溶液中不含乙酸时，其吸光度值为0.115，而溶液中乙酸体积分数为5%时，其测量结果为1.892，两者测量结果相差16倍。表明紫外分光光度法对测试含有乙酸的小分子多肽蛋白的混合物时，其测定结果受到乙酸浓度的影响而不准确。

当添加不同体积分数的无水乙醇时，发现随着溶液中乙醇体积分数的逐渐增大，吸光度值小幅度上升，表明通过紫外分光光度法测定含有乙醇混合物的小分子多肽蛋白含量时，不同浓度的乙醇对测定结果略有影响。

当添加不同体积分数的NaCl时，发现随着溶液中NaCl体积分数的不断增加，其吸光度值基本保持不变，表明采用紫外分光光度法测定混有不同浓度NaCl的小分子量多肽含量时，NaCl的浓度不会影响测定结果。由此可见，紫外分光光度法测定小分子多肽蛋白含量时，酸和醇类干扰物均会影响测定结果，而无机物物质对测定结果几乎无干扰作用。

考马斯亮蓝法又称Bradford法，在测定蛋白含量时主要是利用蛋白质-染料结合的原理进行染色，定量测定蛋白浓度的一种方法，具有快速、可靠、精确等优点[22-23]。本研究中通过考马斯亮蓝法对不同浓度GSH含量进行测定，吸光光度值与浓度不呈现线性关系，表明该方法不适合测定小分子多肽的含量。

双缩脲法测定蛋白质含量主要是基于蛋白质多肽链中两个以上的肽键中发生双缩脲反应，与碱性的铜离子产生紫色络合物，在640 nm处具有最大的吸收值。本研究中通过双缩脲法在低于0.1 mg/mL浓度范围内，其吸光度值不能与浓度拟合线性，表明双缩脲法不适宜对低浓度小分子多肽含量的测定。

本研究结果发现，通过紫外分光光度计法对不同浓度还原型GSH含量的测定结果较好，并通过稳定性试验、精密度试验、重现性试验及回收率试验进一步验证，该方法的相对标准偏差RSD均小于5%，由此可见，UV-S适合于不同浓度的还原型GSH含量的测定。通过乙酸、乙醇和NaCl 3种干扰物试验分析，发现乙酸对还原型GSH含量测定结果影响较大，其次是乙醇，而NaCl对原型GSH含量无影响，表明酸和醇类物质均会影响紫外分光光度计法对小分子多肽含量测定结果。由此可见，紫外分光光度法对低浓度小分子多肽含量的测定快捷、稳定、准确。

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Comparative Study on the Determination of Low Concentration Small Molecule Peptide Content

TANG Kai-yong，ZHOU Hong-xiang*，TIAN Ya-ling，ZOU Cong-li（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Key Laboratory of Fermenting Engineering and Bio-pharmacy，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Abstract：A comparative study of glutathione content was determined by Bradford method，biuret method and ultraviolet-spectrophotometry，the results showed that the ultraviolet-spectrophotometric determination results of reduced low-levelglutathione（GSH）content compared with Bradford method and biuret method were better.The stability，precision，reproducibility and recovery rate were tested by ultraviolet-spectrophotometry，the results showed that the relative standard deviations of four validation tests were less than 5%relative standard deviation.By acetic acid，ethanol and NaCl three kinds of interference test analysis，results showed that the determination of acetic acid had great influence on the reduced GSH content，followed by ethanol，while NaCl had no effect on the prototype of GSH content，it had been discovered that acid and alcohols will affect the ultraviolet spectrophotometric determination results oflow concentration small molecule peptide content method.

Key words：small molecule peptide；Bradfordmethod；biuret method；ultraviolet-spectrophotometry

引文格式：

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.16.027

作者简介：唐开永（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：周鸿翔（1975—），男（汉），副教授，本科，研究方向：食品工艺。

唐开永，周鸿翔，田娅玲，等.低浓度小分子多肽含量测定方法的比较研究[J].食品研究与开发，2018，39（16）：144-148

TANG Kaiyong，ZHOU Hongxiang，TIAN Yaling，et al.Comparative Study on the Determination of Low Concentration Small Molecule Peptide Content[J].Food Research and Development，2018，39（16）：144-148

收稿日期：2018-05-11