胰岛组织中的β细胞是生理状态下唯一产生胰岛素的细胞[1]，胰岛素对维持机体血糖稳态起到了至关重要的作用，胰岛素分泌不足或者利用缺陷会导致糖尿病(diabetes mellitus, DM) 的发生[2]。治疗DM的经典方法是注射外源胰岛素，胰岛移植的成功为治疗DM提供了新的发展方向[3]。体外通过不同的细胞获取具有功能的胰腺β细胞，为解决胰岛移植时供体短缺的问题提供了新的思路。目前报道有胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 和肝脏细胞等可以通过不同方式分化成具有胰岛素分泌功能的β样细胞(β-like cells)[4-9]。然而，这些方法在实际应用中面临着分化效率不高、分泌功能不全、细胞免疫排斥以及体内致瘤性等问题[10]。本文总结了现有体外获得胰腺β样细胞的方法，概述了不同来源细胞在应用时的潜在问题，讨论了针对这些问题的解决方案，并展望了未来胰腺β细胞替代疗法治疗DM的前景。

胰腺主要由外分泌部的腺泡和导管以及内分泌部的胰岛组成。胰岛包含分泌高血糖素(glucagon) 的α细胞、分泌胰岛素(insulin) 的β细胞、分泌生长抑素(somatostatin) 的δ细胞和少量分泌胰多肽(pancreatic polypeptide, PP) 的PP细胞。β细胞是人体内唯一可以分泌胰岛素的细胞，胰岛素对保持血糖的动态平衡起到至关重要的作用[1]。DM是胰岛素分泌不足或利用缺陷所导致的以高血糖为特征的慢性代谢疾病，最常见的类型为1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM) 和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)[2]。T细胞介导的自身免疫反应攻击胰腺β细胞导致胰岛素分泌不足是T1DM的主要病因[11]，T2DM则主要由与环境、遗传等因素相关的胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足导致[12]。DM需进行早期诊断和干预，以防止或减缓其涉及其他器官的潜在并发症，如糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变、心血管疾病和糖尿病足等[2, 11, 13-14]。同时，DM也是多种疾病的并发症[13]，例如最近的研究发现SARS-CoV-2可以感染人胰腺β细胞并导致感染者出现高血糖症状，甚至发生酮症酸中毒；患有DM的感染者的预后较未患DM的感染者也更差[15-18]。根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation, IDF) 2021年的数据，全球成年人中有大约5.37亿的DM患者，这一数字在未来数十年内还将持续增长[19]，这对于国家、社会和患者家庭都是巨大的负担。

目前，外源胰岛素注射是针对T1DM、晚期T2DM和一部分单基因糖尿病的标准疗法，但其无法完全替代内分泌系统对血糖的控制，也难以避免急慢性并发症的发生[10]。胰岛移植(islet transplantation) 成功使T1DM患者实现了脱离胰岛素的长期血糖动态平衡，展现出了β细胞替代疗法的巨大潜力[3]。但胰岛移植存在供体胰岛细胞短缺和免疫排斥等问题，因此并未广泛开展[20]。干细胞分化得到的胰腺β样细胞作为候选供体细胞，有望解决供体短缺问题。ECSs和iPSCs可以分化为表达成熟胰岛标志的β样细胞，并且可以在实验动物体内实现血糖敏感的胰岛素分泌[4-7]。此外，将成体干细胞如MSCs、肝干/前体细胞、胰腺干/前体细胞等作为β细胞替代疗法的细胞来源也取得了一定进展[8-9] (图 1)。

临床胰岛移植开始于20世纪80年代，对于频繁发生严重低血糖和血糖极度不稳定的患者，胰岛移植是目前最合适的治疗方式[21]。捐献者的胰腺经过胶原酶灌注和胰岛分离机Ricordi Chamber的处理获得胰岛，所获得的胰岛经过进一步的纯化和体外培养经过门静脉输注到患者体内以发挥胰岛素分泌的功能[20]。Shapiro等[22]在2000年建立了“埃德蒙顿方案(Edmonton Protocol)”，运用他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素(Rapamycin) 和达克珠单抗(Daclizumab) 取代了具有β细胞毒性的糖皮质激素对患者进行免疫抑制，使胰岛移植这一β细胞替代疗法得以在临床广泛运用。目前胰岛移植患者术后一年生存率达到95%–98%，超过80%的患者血糖得到控制，糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1c) 降低，部分患者可以摆脱对胰岛素的依赖[23-24]。立即经血液介导的炎症反应(instant blood mediated inflflammatory reaction, IBMIR)、免疫排斥和氧化应激等影响移植效果的问题有待通过改良移植术式、优化药物组合或者细胞治疗等方式加以解决；干细胞技术和异种移植技术则有望克服供体短缺的问题[20]。

ESCs是来源于内细胞团的高度未分化细胞，具有多向分化潜能和自我更新能力[10]，此前的研究证明体外培养的ESCs可以自发分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells, IPCs)，但是效率很低[25]。Kubo等[26]和Kahan等[27]在体外诱导分化ESCs获得了胰腺内胚层细胞(pancreas endodem cells, PECs)，D’Amour等[28]则第一个将ESCs分化为表达β细胞标志物胰十二指肠同源盒1 (pancreas duodenal homebox 1, PDX1) 和同源盒蛋白6.1 (NK homeobox factor 6.1, NKX6.1) 的胰腺内分泌细胞(图 1)。通过Pagliuca等[29]和Rezania等[30]建立的体外分化方案获得的功能胰腺β细胞不仅可以响应葡萄糖刺激并分泌胰岛素，而且这些细胞在移植到DM小鼠体内之后可以改善其高血糖状态。ViaCyte公司和Vertex公司分别采用了两种不同的策略于2014年和2021年开始了临床试验，但是受限于临床数据的缺乏和免疫抑制方案的不完善，其安全性和有效性仍有待进一步地确认和优化[31]。在最近的研究中，Nair等[5]运用流式细胞分选术(fluorescence activated cell sorting, FACS) 将体外培养的未成熟的β样细胞进行重聚集后继续培养获得了功能更好的β样细胞，证明了未成熟β样细胞的聚集对其后续成熟和分化为具有更强动态胰岛素分泌功能的细胞具有重要作用。这一策略不仅增加了干细胞来源β细胞(stem cell-derived beta cells, SC-βC) 和成体胰腺β细胞的结构相似性，也增加了二者在转录组学和功能上的相似性。TGF-β通路的激活在胰腺发育和干细胞向β细胞分化过程中起关键作用，但其对于β细胞胰岛素分泌功能的调节作用则具有多种可能：TGF-β通路下游SMAD2/SMAD3激活时，将会促进胰岛素的分泌并有利于β细胞数量的维持；但单独激活SMAD3时则会使得β细胞功能下降[32-34]。Velazco-Cruz等[4]在改进分化方案时提出，添加活化素受体样激酶5抑制剂(activin receptor-like kinase 5 inhibitor, ALK5i) 抑制TGF-β通路是ESCs分化为β样细胞的必要条件，但是在获得内分泌细胞后持续抑制TGF-β通路将使得细胞的胰岛素分泌功能下降。通过调节分化方案中ALK5i的暴露时间，Velazco-Cruz等获得了表达β细胞标志且具有良好胰岛素分泌功能的SC-βC。Balboa等[35]在分化的最后成熟阶段向培养基中添加甲状腺素T3、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine) 和具有抗增殖作用的极光激酶(aurora kinase) ZM447439，经过6周的培养获得了具有双相胰岛素分泌能力的功能和结构更接近原始胰岛的干细胞来源胰岛(stem cell-derived islets, SC-islet)。然而，使用ESCs进行实验所面临的伦理争议是限制其研究进一步深入和进入临床试验的关键问题。

从成体细胞重编程而来的iPSCs可以很好地避免ESCs面临的伦理限制；取自患者自身的细胞也可以一定程度上解决免疫排斥的问题[8]。通过基因重组技术[36]、微RNA (microRNA, miRNA) 调控[37-38]等方法，可以获得表达PDX1、NKX6.1、胰岛素(insulin, INS) 等胰腺和胰岛细胞特征标志物的细胞(图 1)，但是通过这些技术获得的细胞的胰岛素分泌能力显著低于正常人胰腺β细胞，且细胞团中有部分为α细胞。此外，引入外源基因和病毒载体可能使得iPSCs的致瘤风险升高，也可能在移植后导致自身免疫的发生[8]，有研究希望通过使用仙台病毒作为载体以避免外源基因和宿主基因组的整合来克服上述问题[39-40]。三维培养可以提高iPSCs的分化效率[41-42]。Manzar等[42]运用三维生物支架(3D bio-scaffold) 培养了T1DM患者体细胞来源的iPSCs并对其进行去甲基化处理后获得了成熟的β细胞，iPSCs在不同阶段的不同化合物作用下经历定型内胚层(definitive endoderm)、后前肠(posterior foregut)、胰腺前体细胞的阶段之后，加入Noggin和维甲酸的同时抑制TGF-β通路及Notch通路使其分化为胰腺内分泌前体细胞；最后通过添加胰岛素的特异性诱导剂尼克酰胺(nicotinamide)、甲状腺素T3、胰岛素样生长因子1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) 等促进β细胞成熟；表观遗传修饰因子5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-DC) 则被用于去甲基化处理以改善胰岛素分泌细胞的分化过程。Du等[43]近期将化学诱导的SC-βC移植到非人灵长类DM模型体内，恢复了其内源性胰岛素的分泌，改善了其血糖控制情况。这一实验的成功证明了人多能干细胞用于临床治疗的可能性，为临床转化做出了初步探索。

MSCs包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)、胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cells, PMSCs) 和脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs) 等，相较于ESC和iPSC其致瘤风险更低[8]。通过基因工程的方法在MSCs内过表达Pdx1、神经元素3 (neurogenin-3, Ngn3)、配对盒4 (paired box 4, Pax4) 等基因或者运用基因编辑的手段可以获得IPCs[44-45] (图 1)。“华通氏”胶间充质干细胞(Wharton’s jelly mesenchymal stem cells)、BMSCs和ADSCs等在体外经尼克酰胺、促胰岛素分泌素4 (extendin-4)、激活素A (activin A) 等化合物处理也可以得到分泌胰岛素和表达胰腺相关转录因子的胰岛样细胞(islet-like cells)[46-49]，这些细胞的功能也在动物模型体内得到了初步检验[48, 50-51]。然而，MSCs跨越中胚层的转分化使得其获得IPCs的效率明显低于ESCs和iPSCs，临床获取和运用MSCs来源的功能β样细胞进行细胞替代治疗仍有待进一步研究[52-53]。值得一提的是，除了作为细胞替代治疗的细胞来源，MSCs还可以通过调节患者自身免疫，改善受损β细胞修复和再生微环境的作用来发挥治疗DM的功能，围绕MSCs的这些研究近年来有大量的临床试验正在进行[52, 54-55]。

肝脏和胰腺在发育过程中都来自于内胚层，因此肝脏细胞被视作是获取功能胰腺β细胞的良好来源[56-57]。转录因子PDX1在胰腺前体的早期发育和β细胞的功能维持过程中发挥关键作用[58]。在过往研究中，本课题组通过逆转录病毒载体在永生化的肝脏上皮前体细胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs) 中表达Pdx1基因获得了PDX1+的细胞，处理后的细胞还可以表达Ngn3、Nkx6.1、NeuroD等β细胞特征基因(图 1)。PDX1+的LEPCs在高糖培养基中失去肝脏细胞标志并分化为具有胰岛素分泌功能的功能β细胞，在移植到DM小鼠体内后可以有效缓解其高血糖状态[59]。该研究为肝脏细胞向β细胞的转化提供了依据，但分化效率也有待进一步提高，病毒载体和永生化细胞带来的安全性问题也有待解决。最近，Chang等[58]通过腺病毒载体向原代肝细胞内同时导入Pdx1和Ngn3基因，并将这些细胞培养于含有GLP-1、exendin-4和血小板衍生生长因子二聚体(homodimers of platelet-derived growth factor-A, PDGF-AA) 的高糖培养基中，显著提高了细胞转分化的效率，这些肝细胞来源的β样细胞在移植到DM小鼠体内亦可发挥降血糖的功能。Yang等[60]则采用非病毒的方法在体内对肝脏细胞进行重编程获得了IPCs，所获得的IPCs可以表达胰岛成熟标志基因尾促皮质肽3 (urocortin 3, Ucn3) 并改善小鼠的血糖调节能力。Yang等的这一方法不仅避免了病毒载体引入外源基因导致的安全性问题，并且通过体内重编程的方式避免了细胞移植带来的免疫排斥问题。现有的研究提示，并非所有肝脏细胞都具有胰向分化的倾向，因此合适的细胞分选标志和方法将是值得研究的方向。此外，Wnt信号通路的激活和分化过程中针对肝脏细胞的表观遗传修饰将有助于实现更高效地获取β样细胞，促进分化后细胞的血管化和改良细胞微环境则将有利于提高β样细胞体内和体外的存活率和移植后功能的发挥[57]。

肝外胆道系统包括胆囊、胆总管、肝管等组织，相关研究表明位于这些组织的细胞中存在有PDX1+的细胞，且在一定条件下可以分化为胰腺β样细胞[61-62]。有研究运用Kubota’s培养基从胆周腺和胆囊上皮细胞中筛选出了具有干性的细胞，并通过维甲酸、维生素C等化合物诱导分化得到了可以产生胰岛素的胰岛样细胞[62-63]。Hickey等[64]和Wang等[65]运用腺病毒载体在胆囊上皮细胞中表达Pdx1、MafA、Ngn3等基因，成功获得了INS+的β样细胞(图 1)。他们的方法效率更高，获得的细胞同时呈现出胰腺其他细胞的特征，但没有葡萄糖刺激后分泌胰岛素的功能，与成熟β细胞相比功能较弱。本课题组前期通过建立胰岛素启动子(insulin- promoter) 驱动的Cherry-expression胆囊上皮细胞系，筛选出了添加Noggin、抑制ERK和Hedgehog信号通路的条件，可以得到PDX1+/NKX6.1+的IPCs，将其移植到DM模型小鼠体内后可以显著改善小鼠的DM症状[9]。该方法优势在于使用了过程可控和操作便捷的化学诱导方法，同时缩短了分化时间，并且不表达α细胞特异的标志物，为体外获取功能β细胞提供了更为有效和便捷的方法。在后续研究中，通过三维培养的方式有望构建类似于胰岛结构的细胞团，进一步促进目的细胞的分化和功能成熟。

成体胰腺干/前体细胞具有良好的分化潜能和增殖能力，也有望成为获取功能胰腺β细胞的起始细胞[66]。通过基因重组技术实现β细胞关键基因的过表达或者关键转录因子NGN3的激活可以实现胰腺导管细胞向β细胞的转分化；人胰腺腺泡细胞则可以通过STAT3和MAPK信号通路的激活从而诱导获得NGN3+/ INS+的β样细胞[67] (图 1)。胰岛内的α细胞和δ细胞也被证实可以转分化为β细胞[68-69]，除了常用的基因工程手段之外，GLP-1类似物、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA) 和青蒿素也参与促进α细胞向β细胞分化[70-71]。近期科学家在胰岛内鉴定出了一群“原始β细胞亚群”细胞，为获取功能胰腺β细胞提供了更多来源[72]。

胃肠道细胞具有很强的再生能力，不仅具有很多和β细胞类似的内分泌细胞，而且具有免疫豁免的特性，这些优点使得研究胃肠道细胞向β细胞的分化成为可能[73-74]。通过Pdx1、Ngn3和MafA的异位表达可以在小肠隐窝内获得上皮细胞来源的β样细胞[75] (图 1)。虽然也有其他研究实现了类似的转分化，但受限于肠道细胞表面标志尾型同源盒转录因子2 (caudal-type homeobox protein 2, CDX2) 的存在使得分化并不完全，效率也较低[56]。通过β细胞关键基因的过表达同样可以高效地诱导胃细胞分化为INS+细胞，并且可以获得良好的胰岛素反应能力[76]。虽然技术尚未成熟，但胃肠道细胞凭借其易获取和易转化的特点获得了越来越多的关注。

类器官是在体外培养的包含有来自多能干细胞或成体干/前体细胞来源的特定器官细胞的三维结构[77]。胰岛类器官可以很好地模拟胰岛在体内的空间组织、细胞间相互作用以及与微环境的相互影响，不仅可以作为胰岛发育和相关疾病的研究模型以及为药物筛选提供平台，也有望解决胰岛移植的供体不足的困难[78-80]。目前一般有3类细胞可以作为胰岛类器官的种子细胞，来源于多能干细胞的胰岛细胞、去分化和再分化的成体胰岛细胞来源的胰岛内分泌细胞、可以被转分化为胰岛细胞的其他非胰岛系细胞[77]。此外，内皮细胞(endothelial cells, ECs) 和MSCs也被证实可以促进胰岛类器官的结构和功能形成[81-84] (图 2)。WANG等[1, 85]以细胞标志C蛋白受体(protein C receptor, Procr) 在小鼠成体胰腺中鉴定出了一类全新的胰岛前体细胞，将其与ECs在体外共同培养获得可以稳定扩增的对葡萄糖敏感且能够分泌胰岛素的胰岛类器官，将该胰岛类器官移植到DM小鼠体内之后可以有效缓解其DM症状。另外的研究指出，非经典的WNT4信号(non-canonical WNT4 signaling) 在iPSC来源的胰岛类器官胰岛素分泌功能的体外成熟过程中发挥了关键作用，所获得的胰岛类器官包含有导管细胞和各类内分泌细胞在内的多种细胞，很好地模拟了成体胰岛的细胞组成和分泌功能；如果运用基因工程手段在iPSCs内增加免疫检查点蛋白PD-L1的表达，可以使移植到DM小鼠体内的胰岛类器官存活更长时间并持续改善小鼠的DM症状[81]。三维培养的方法是胰岛类器官的制备的关键技术[77]；除了传统的细胞自聚集(self-aggregation)[86-87]和水凝胶包埋[88]的方法之外，脱细胞支架[89]、3D生物打印[90]和器官芯片技术(organs-on-chips)[91]也推动了胰岛类器官研究的发展。目前，胰岛类器官的发展聚焦于如何优化类器官细胞的组成和结构使得其结构和功能进一步向真实器官靠拢，与此同时如何提高类器官的存活时间和安全性也是亟待解决的问题[77]。

体外获取功能β细胞的尝试取得了阶段性进展，但是如何将这些细胞安全有效地应用于临床，还存在很多难点和问题。近期有很多研究为解决这些问题提供了新的方法和思路。

虽然目前体外获取的SC-βC可以表达绝大多数已知的成熟β细胞标志分子，但这并不意味着其本身功能的完全成熟，功能成熟的验证需要通过对其对葡萄糖刺激的动态响应和胰岛素分泌机制的研究[10]。细胞微环境对β细胞的成熟至关重要，这也是目前往往需要通过将SC-βC移植到体内完成最终功能成熟的原因[29, 43]。单细胞测序的结果证实，移植到体内6个月后的SC-βC不仅具有胰岛素分泌能力，而且与未移植的分化后细胞相比表达更多β细胞成熟标志物[92-93]。但是这样的方法无疑推迟了SC-βC发挥功能的时间，而且在体内的分化和成熟方向也难以实时确认。除了微环境的影响之外，移植物的血管形成也影响着SC-βC移植后的存活和功能发挥[94]。ECs的信号对β细胞的发育、增殖、分化等发挥关键作用[95]。通过脂质体转导修饰后的Vegfa mRNA可以有效提升移植物血管化程度并增加β细胞数量[96]。

多能干细胞具有强大的自我更新和多向分化潜能，这使得其可以作为体外获取功能β细胞的种子细胞，但同时也带来了肿瘤发生的风险。不论是ESCs还是iPSCs，在向β细胞分化的过程中都难以达到100%的分化效率，所取得的细胞团中仍存在部分具有致瘤性的未分化细胞[10]。此外，制备iPSCs过程中常引入的原癌基因c-Myc和病毒载体也增加了iPSCs成瘤的风险[8, 79]。使用其他谱系的细胞转分化获取β细胞时则还没有致瘤的报道。现在胰岛移植主要的方法是门静脉输注，这是一种不可逆的移植方法[97]，已经有研究尝试进行皮下或者肌内移植以便于观察移植物的存活状态并在肿瘤发生时及时将其移除[13, 20, 98]。除了优化移植部位之外，研究希望通过改良分化方案和细胞培养技术从而尽可能地提高成熟且具有既定功能的细胞比例[4-5]。与之对应的，也可以运用化学或者免疫学的手段剔除未分化的细胞[99-100]。运用基因工程的手段向ESCs或iPSCs细胞中导入自杀基因的方式也为降低移植后形成肿瘤风险提供了新思路[101-102]。

由于人类白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA) 不匹配导致的免疫排斥反应也是β细胞替代疗法面临的一大难题，目前主要依靠运用免疫抑制剂来避免这一问题。但这一方法存在诸多副作用，严重时甚至会导致致命的感染和肿瘤发生[103]。iPSCs一般来自于患者自身细胞，具有最低的免疫原性，但是这样个体化的方式价格昂贵且耗时很长，难以满足临床需求[10]。调节性T细胞(regulatory T cell, Treg) 治疗被证实可以增强同种异体移植物的免疫耐受能力并有效避免自身免疫反应[104]，针对T1DM患者进行的临床试验验证了这一方法的有效性和安全性[105]，如何获取足够治疗用的Treg细胞并保证其纯度是目前有待进一步优化的方向[106]。通过CRISPR/Cas9技术向β细胞内导入IL-10基因可以使其自身部分模拟Treg细胞的作用以调节免疫反应[107]。基因编辑技术也可以通过干扰HLA和免疫调节因子相关基因的表达从而降低移植细胞的免疫原性[108-109]。另外，MSCs和β细胞的共移植可以有效减少效应T细胞和炎症细胞因子的数量并增加Treg细胞数量，促进移植物的血管形成并且发挥免疫调节作用，有效地提升了移植物的存活率[110]。由于目前常用的门静脉输注移植方式会使得体积很小的MSCs在肺部被清除，所以有研究尝试通过富集MSCs的细胞产物用于免疫调节的治疗[111]。通过生物材料包裹SC-βC的方式近年来得到了很多研究，这一方式不仅可以在保证SC-βC获得足够营养并保持激素分泌功能的前提下躲避免疫攻击，而且可以使得移植物状态更加可控并且可以在必要时被取出，提高了移植的有效性和安全性，为β细胞替代治疗提供了新的方案[112]。

随着DM患者人数不断增加，对公共健康的影响日益加深，人们对新的治疗方法有了更高的期望。随着科学研究的深入，SC-βC展现出了其巨大的临床应用潜能和研究价值，已经有大量的实验证明了在体外获取和培养可以用于移植的β细胞的可能，未来需要解决的问题主要在于如何提高分化效率和细胞存活率、如何增强其免疫耐受能力以及如何避免其致畸致瘤的风险。除此之外，SC-βC和胰岛类器官还可以被用于毒物和药物筛选、β细胞发育生物学研究和DM体外模型的构建，为进一步了解DM机理并开发新的治疗手段提供了平台[113]。随着分化方案的不断优化和相关技术的不断进步，部分SC-βC的研究已经进入到了临床试验阶段并取得了良好的疗效，β细胞替代疗法在DM的临床治疗中得到广泛运用或将成为可能。