文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明涉及生物活性物质提取领域，具体包括DMSO高效提取盐藻类胡萝卜素的方法。

背景技术

巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)是单细胞盐藻，可在含0.05–5M NaCl的培养基中正常生长，在户外大规模培养中抗污染能力较强。它具有如下优点：光合自养、抗逆性强及培养条件简单；无细胞壁，有利于遗传转化；富含类胡萝卜素和甘油，营养价值较高。

目前国内类胡萝卜素大部分靠进口，且国内生产的天然类胡萝卜素是从果蔬中提取得来的，例如胡萝卜、玉米、马铃薯等，但这些原料中有效成分较低，生产成本高。相比之下，以盐藻为原料，对类胡萝卜素进行提取利用，具有许多显著优势。例如，盐藻生长比较迅速、容易培养、产量较高、受季节影响较小、其适应性强，在污水中也能进行生长繁殖等。因此盐藻是首个被认为其具有潜在的商业价值且用来生产β-胡萝卜素的藻类。到目前为止，美国、澳大利亚、以色列等多个国家已经利用盐藻进行大规模生产天然β-胡萝卜素。在我国，也存在利用当地环境优势大量养殖盐藻来提取β-胡萝卜素的现象，例如的内蒙古的吉蓝盐场。

加强对盐藻中类胡萝卜素的研究和开发，不仅可以扩大天然类胡萝卜素的来源，满足当前社会上各领域逐年增长的需求量，还能实现藻种价值的充分利用，以此带来可观的经济效益。目前，国内外学者对盐藻中类胡萝卜素的提取工艺优化进行了相关研究，报道并总结出了许多有关提取类胡萝卜素的方法和技术。利用盐藻生产、获取类胡萝卜素需要经过以下三个过程：盐藻的培养、藻体的采收以及类胡萝卜素的提取纯化。其中，藻体的采收和类胡萝卜素的提取对生产成本的高低具有决定性作用。从盐藻中提取类胡萝卜素常用的方法有：有机溶剂提取法、原位萃取法和超临界二氧化碳萃取法等，但到目前为止都没有一种可以真正地实现经济、环保而又高效地提取的方法。相比而言，有机溶剂提取法操作最简便，影响因素容易控制，所需的仪器设备较少，成本较低，整个过程的安全性也是较高。因此，可以通过对有机溶剂提取法的各提取因素进行优化，不断完善及简化提取步骤，进而有效推进巴夫杜氏藻的开发利用和类胡萝卜素的商业化生产。

发明内容

本发明以巴夫杜氏藻为原料，选择三因素五水平的响应面分析试验，评价各因素之间的交互作用对巴夫杜氏藻中类胡萝卜素提取的影响，通过回归分析建立提取率与提取因素之间的关系，从而对巴夫杜氏藻中类胡萝卜素的提取条件进行优化。

本发明的目的是提供DMSO高效提取盐藻类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

a.取摇匀的盐藻培养液于离心管中离心，弃去上清液；重复离心，弃去上清液；然后在藻泥中按盐藻培养液与DMSO体积比为1mL：410-900μL加入DMSO，置于漩涡混合器上震荡，直至藻泥块充分混合并溶解于DMSO中；

b.藻泥块和DMSO混匀后置于40-60℃下的恒温金属浴中浸提10-20min；

c.浸提后离心，上清液为提取得到的盐藻类胡萝卜素溶液。

优选地，步骤a中所述的盐藻培养液与DMSO体积比为1mL：410μL；

优选地，步骤b中所述的浸提是置于57℃下的恒温金属浴中浸提12min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明对巴夫杜氏藻中类胡萝卜素的提取条件进行优化，为今后巴夫杜氏藻中类胡萝卜素的提取和利用提供一定的理论基础。本发明可降低DMSO用量，并同时提高了对类胡萝卜素的提取率，节约成本的同时可有效地保护环境。

附图说明

图1为不同提取试剂对盐藻类胡萝卜素的提取率。

图2为DMSO提取盐藻类胡萝卜素在不同条件下的预测响应值与实际响应值对比图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。

实施例1最佳提取试剂的确定

根据类胡萝卜素的溶解性和查阅的文献，选择二甲基亚砜(DMSO)、95％乙醇、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、石油醚作为提取试剂。取出1mL摇匀的巴夫杜氏藻培养液于离心管中，在12000rpm转速下离心5min，弃去上清液；在相同的转速下进行重复离心1min，弃去上清液；然后在藻泥中分别加入1mL上述6种提取试剂，置于漩涡混合器上震荡，直至藻泥块充分混合并溶解于提取液中。混匀后置于60℃下的恒温金属浴中浸提20min，之后以转速12000rpm离心2min。最后吸取300μL上清液于酶标板中，作为检测液，用Epoch 2T微孔板分光光度计检测其在480nm、649nm、665nm三个波长下的吸光值，研究不同提取试剂的提取效果。每组进行三个重复试验。根据下列公式计算出类胡萝卜素的提取率。

chla＝12.47×A

chlb＝25.06×A

C＝(1000×A

式中：chla为叶绿素a的浓度；chlb为叶绿素b的浓度；C为样品中类胡萝卜素的含量，μg/mL；Y为类胡萝卜素的提取率，‰；V为提取试剂的体积，μL；m为样品中盐藻的干重，mg。

结果如图1所示，类胡萝卜素能溶解于大多数有机溶剂中，但不同的提取试剂对巴夫杜氏藻中类胡萝卜素存在不同的提取效果。在本实验所选的六种提取试剂中，其提取效果从大到小依次为DMSO>95％乙醇>无水乙醇>丙酮>乙酸乙酯>石油醚，其中DMSO的提取效果最佳，95％乙醇次之，而石油醚的提取效果最差。因此，在后期对其它提取条件进行优化的实验中，选择DMSO作为提取试剂。

实施例2响应面优化试验设计

在初步探究最佳提取试剂和查阅相关参考文献资料的基础上，利用设计专家(Design-Expert 10.0.4)分析软件，根据中心复合设计(CCD)实验原理，确定以巴夫杜氏藻中类胡萝卜素的提取率作为响应值，以提取时间(A)、提取温度(B)、提取试剂量(C)作为影响因子，在一定数值范围内进行试验设计以及条件的优化，最终得到最佳提取率。

根据本次试验设计，对提取时间(A)、提取温度(B)、提取试剂量(C)这三个因素的各5个水平进行了研究，实验因素水平具体设置如表1所示。利用CCD设计得出下列的实验方案，总共20组，每组进行三个重复试验，详见表2。

表1 CCD中各因素和水平的设置

表2实验方案设计

根据中心复合设计(CCD)原理所设计的方案，分别加入1mL盐藻培养液进行实验，参照实施例1的实验步骤进行了相关实验后，最终计算得到不同提取条件下类胡萝卜素提取率的结果，见表3。用Design Expert将表3中所得数据进行回归拟合分析，可得响应变量提取时间(A)、温度(B)、提取试剂量(C)对提取率(Y)的回归方程为：

Y＝54.09-1.12A+4.43B-0.74C+5.32AB+4.68AC-2.71BC-1.57A

利用Design-Expert对表3中的实际提取率进行Diagnostics分析，得到实际提取率与预测值之间的关系，如图2所示。在该图中，试验点越靠近直线，则实际提取率值越可靠。根据该图分析可知，大多数的试验点都分布在理论线附近，表明本次试验的实验值与理论值相差不大，两者之间存在较好的相关性。

表3 CCD分析结果

表4响应面方差分析

注：*(p

根据表4可知，该模型的F值为20.34，p值为0.0007

实施例3验证实验

通过模型的分析及类胡萝卜素最优提取条件的预测，得出在提取时间为11.35min、温度为57.157℃、提取试剂量为410μL时，类胡萝卜素提取率预测值最高，可达0.576‰。为了验证响应面法中该回归模型对提取条件优化的准确性，对所预测的最优提取条件进行合理而简单化调整，即提取时间改为12min、温度为57℃、提取试剂量为410μL，设置3次平行验证性试验，结果类胡萝卜素提取率为0.517‰，比对照DMSO的提取率(0.393‰)提高了31.55％，该实验的验证值与回归模型预测的提取率值相差不大。综合上述实验结果，可以证明该模型真实可靠，可以对类胡萝卜的实际操作提取具有一定的参考意义。