研究一：ROS1基因与化疗疗效

编码ROS1原癌基因受体酪氨酸激酶（ROS1）的基因的染色体重排定义了非小细胞肺癌（NSCLC）的一个独特的分子亚群。约1%至2%的非小细胞肺癌患者发生ROS1重排。ROS1融合已被确定为驱动基因，已确定的融合伙伴包括CD74、SLC34A2、TPM3、SDC4、EZR、LRIG3、KDELR2和CCDC6。由于高度相似的酪氨酸激酶结构域，临床研究前和临床研究数据表明ROS1可以通过ALK抑制剂来靶向治疗。几项有限患者的研究表明，ALK抑制剂克唑替尼对患有ROS1易位患者的非小细胞肺癌有效。在中国，由于缺乏疗效和毒性数据，克唑替尼并不常用于ROS1易位的NSCLC患者。化疗药物是目前治疗ROS1易位NSCLC患者的标准。对于ROS1易位的患者，目前临床上推荐以铂类为基础的化疗。

在ALK易位患者中，以培美曲塞为基础的治疗方案的疗效优于其他方案。此外，在接受培美曲塞化疗的非小细胞肺癌患者中，较低的TS水平与较好的临床疗效显著相关。近期研究表明，与ALK易位相比，ALK易位肿瘤标本中的TS mRNA水平明显降低，这可能部分解释了该人群中培美曲塞化疗的临床结果。然而，与ALK易位非小细胞肺癌相比，ROS1易位的发生率较低，因此对ROS1易位标本中TS mRNA水平的研究并不充分。目前尚无培美曲塞化疗疗效的临床疗效数据。

肺腺癌患者34例，其中男性16例，女性18例，发现ROS1易位，发生率为1.9%（34/1750）。4例患者有吸烟史。根据病理及临床分期，确诊为IIIB/IV期15例，诊断为I- IIIA期19例。

表1：不同基因状态临床病理特征比较

本研究共选择了46例ALK易位患者，32例KRAS突变患者，50例EGFR突变患者，42例EGFR/ALK/ROS1/KRAS野生型患者与ROS1阳性患者。ROS1阳性和ROS1阴性患者吸烟史有差异。其他方面各组在性别、年龄、分期和组织学上均无差异。

共有23例ROS1易位患者接受一线姑息性化疗（15例诊断时为IIIB/IV期，8例复发）。12例ROS1易位患者接受铂/培美曲塞一线治疗，另外11例接受铂类为主的双药方案治疗（7例使用吉西他滨，4例使用多西他赛）。6例患者接受了单药培美曲塞作为二线或三线治疗，13例接受了另一种单药治疗。所有患者在一线治疗后均未使用维持疗法。采用一线铂/培美曲塞的中位PFS为6.8个月，而其他以铂为基础的双重方案的中位PFS为5.0个月（P=0.040）。接受单药培美曲塞的患者的平均PFS为4.7个月。相比之下，使用其他单药的中位PFS为3.3个月（P=0.958）。总的来说，在选择用于比较的170名患者中，有27名、22名、34名和27名ALK易位、KRAS突变、EGFR突变和EGFR/ALK/ROS1/KRAS野生型患者接受了一线铂/培美曲塞治疗。所有患者一线铂类/培美曲塞化疗的平均PFS为5.2个月。ROS1易位、ALK易位、EGFR突变、KRAS突变和EGFR/ALK/ROS1/KRAS野生型患者的PFS分别为6.8、6.7、5.2、4.2和4.5个月（P =0.003）。一线铂类/培美曲塞化疗的PFS在ALK/ROS1阳性和ALK/ROS1阴性患者之间有明显差异（6.7对4.6个月，P6个月

图1：EGFR 20突变PFS和OS

图2：EGFR 20突变单纯突变与复合突变PFS和OS

研究五：MET过表达特征

肺癌是中国癌症相关死亡率的主要原因。表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)是肺腺癌最常见的两个靶点。针对这两个基因的抑制剂(厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼用于EGFR突变；克唑替尼和替尼替用于ALK重排)已显示出富有希望的临床疗效。其他基因，如ROS1和MET突变，也受益于靶向治疗。

虽然大多数EGFR突变患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)有很好的疗效，但10-20%的患者对EGFR-TKIs无效。T790M突变和MET过表达与EGFR-TKI继发耐药有关。原发耐药是临床实践中的另一个挑战。已知致癌基因中共存的基因改变与EGFR-TKIs的原发耐药性有关。然而，大多数研究集中在ALK和EGFR的同时突变。其他基因，如MET过表达和HER2扩增还不是很清楚。几项研究表明，大约20-50%的非小细胞肺癌患者有MET过表达。然而，在EGFR-TKIs治疗的EGFR突变患者中，EGFR和MET同时过表达的频率和MET过表达的作用尚不清楚。此外，先前的研究表明，MET过度表达的患者生存率较低。然而，它在EGFR突变患者中的作用仍然存在争议。

在167名EGFR突变患者中，有95名男性和72名女性，平均年龄为59岁。所有患者均经病理证实为腺癌。有76名既往或目前仍吸烟者和91名未吸烟者。

表1：单纯EGFR突变和MET/EGFR改变患者

表2：单纯EGFR突变和MET/EGFR改变患者疗效比较

其中19号外显子缺失81例，21号外显子L858R突变72例，其他14例。MET阳性57例，其中MET(3+)19例，MET(2+)38例。年龄、吸烟、性别和EGFR突变类型之间没有关联。

图1：单纯EGFR突变和MET/EGFR改变患者PFS比较（P=0.027）

图2：MET（2+）与MET（3+）患者PFS比较（P=0.582）

图3：单纯EGFR突变和MET/EGFR改变患者OS比较（P=0.078）

有效率为68.9%，疾病控制率为83.8%。其中81例EGFR单一突变患者部分缓解(73.6%)，病情稳定(15.5%)。进展性疾病9例。有效率73.6%，疾病控制率91.8%。EGFR/MET(+)组有效率为59.6%，疾病控制率为73.7%。中位PFS为10.8个月(95%CI，9.7-11.9)。EGFR单纯突变组和EGFR/MET(+)组的PFS值分别为10.9个月(95%CI，9.4-12.4)和10.6个月(95%CI，8.0-13.1)(P=0.027)。MET(2+)和MET(3+)患者的PFS差异无显著性(11.0vs.8.8月，P=0.582)。EGFR单纯突变患者的ORR明显高于EGFR/MET(+)突变患者(73.6%vs.59.6%，P=0.06)。单纯EGFR突变患者的疾病控制率(91.8%)高于EGFR/MET(+)突变患者的疾病控制率(73.7%，P=0.0015)。67例(60.9%)和38例(66.7%)患者分别在EGFR和EGFR/MET(+)患者中接受进一步化疗。两组均未观察到其他治疗类型。中位OS为19.0个月(95%CI，17.7-20.5)。EGFR单纯突变组和EGFR/MET(+)组的OS值分别为21.0月和17.0月(P=0.078)。

大约30%的EGFR突变患者同时出现MET过度表达。MET过度表达与EGFR-TKI疗效较差相关。

研究六：MET基因扩增特征

肺癌是世界上最主要的癌症死亡原因。对非小细胞肺癌(NSCLC)分子特征的深入了解，导致了更多的治疗选择。随着EGFR、EML4-ALK和ROS1等驱动基因的发现，肺癌的治疗发生了迅速的变化，延长了患者的生存时间。MET受体酪氨酸激酶及其配体肝细胞生长因子被确定为肺癌的治疗靶点。MET基因异常可分布于多种机制，包括过度表达、激酶激活、外显子突变。MET基因扩增被认为是导致获得性EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药的原因之一。多项研究表明，对EGFR抑制剂治疗产生获得性耐药的患者中，约有5%至20%存在MET扩增。根据目前的知识，在接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗初治患者中发现了MET扩增；据报道，在白种人人群中，这一频率约为3%至10%。13-15有MET扩增的患者据报道可从MET抑制剂中获益。但是，频率，临床病理特征尚不明确，据目前所知，在亚洲人群中尚无关于大量参与者的研究报告。越来越多的研究发现MET在NSCLC中过表达。然而，关于它的发生频率和预后价值存在争议。据报道，NSCLC中的大多数驱动基因都是相互排斥的。因此假设在EGFR野生型患者中MET扩增的频率可能会丰富。在之前的研究的基础上，本研究评估了来自中国4个机构的EGFR野生型NSCLC患者中MET基因扩增和过表达的患病率；并试图揭示临床病理特征与MET基因异常预后之间的相关性。

该研究共纳入791名中位年龄为61岁（范围为28-80岁）的NSCLC患者。在791例患者中，男性409例（51.7％），女性382例（49.3％）。 622例患者患有腺癌，105例鳞状细胞癌和64例其他亚型的组织学。曾经吸烟或吸烟的为353人（占44.6％），而不吸烟者为438人（占55.4％）。根据第7版TNM分期，将197例患者（24.9％）归为I期疾病，将121例患者（15.3％）归为II期，242例患者（30.6％）归为III期，191例患者（24.2％）IV期。

表1：本研究患者临床特征

表2：MET扩增患者临床特征

表3：MET扩增与非扩增患者临床特征比较

表4：OS的单因素和多因素分析

8例患者被确认具有MET扩增，包括5例高扩增和3例中度扩增。在8例患者中，男性5例，女性3例。中位年龄为60岁。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在所有8例患者中检测到ALK，ROS1和KRAS；没有发现阳性病例。在有和没有MET扩增的患者之间未发现临床病理特征的关联。在有和没有MET扩增的患者中，年龄（P=0.95），性别（P=0.80），吸烟状态（P=0.96）或组织学类型（P=0.85）均无统计学差异。在晚期和以实性为主的腺癌中，MET扩增更为频繁。

在791名患者中，回顾性选择395名患者进行IHC检测。在接受IHC分析的患者中，138名患者被发现为MET阳性。在35例中观察到强表达(3+)，在103例中观察到中度表达(2+)。在8例MET扩增的患者中，3例通过METIHC染色进行评估，其中1例强表达(3+)，2例中表达(2+)。

图1：MET扩增FISH和MET表达免疫组化

图2：MET表达与MET扩增患者OS

所有患者的中位OS为57.9个月(95% CI，53.3-62.4)。晚期(III期/IV期)、MET表达阳性和MET扩增与不良OS显著相关(分别为P=0.004和0.001)，而年龄、性别和吸烟状况对OS无显著差异。以分期、MET扩增和MET表达为变量，建立了多变量Cox回归模型。多变量分析确定MET表达和疾病晚期是恶化生存率的最强独立预后因素。

一名71岁的妇女，从不吸烟，因呼吸困难和体重减轻就诊。影像显示右下叶肿块，纵隔淋巴结病和骨转移。肺肿块活检显示肺腺癌。EGFR、ALK和ROS1检测呈阴性。她接受了培美曲塞(500 mg/m2)和卡铂化疗作为一线治疗。治疗4个周期后的影像显示疾病进展，在右叶有新的淋巴结。MET检测显示高扩增。她加入了当前的研究；她于2015年2月5日接受了克唑替尼治疗(每天2次，每次250毫克)；影像显示1个月后有部分反应。她继续克唑替尼治疗，直到最后一次随访。

图3：克唑替尼治疗前与治疗后对比

本研究数据表明，MET扩增在EGFR野生型非小细胞肺癌患者中很少见。在EGFR突变阴性的患者中，MET表达而非扩增是一个独立的不良预后因素。

研究七：PIK3CA基因突变特征

肺癌目前是中国癌症相关死亡率的主要原因。非小细胞肺癌约占肺癌的80%。大多数非小细胞肺癌患者在诊断时已经达到晚期；因此，姑息化疗成为一个主要的选择。然而，疗效相当令人失望。在过去的十年里，分子疗法已经成为一种新兴的疗法。由于毒性较小，具有敏感分子改变的患者可以从抑制剂治疗中比传统化疗受益更多。已知PIK3CA基因编码PI3K蛋白的p110α催化亚单位。其突变导致蛋白激酶B信号的激活，在各种生理和病理细胞过程中起重要作用。在多种人类癌症中检测到PIK3CA突变。非小细胞肺癌的发病率为2-7%，在肺鳞癌中比在肺腺癌中更常见。在没有服用EGFR-TKIs的患者和对靶向治疗有耐药性的患者中都可发现了PIK3CA突变。此外，对于存在PIK3CA突变的患者，特别是PIK3CA和EGFR同时发生基因改变的患者，其治疗选择还没有得到很好的研究。本研究从810例肺腺癌患者中筛选出PIK3CA突变，并对其频率、治疗和预后进行评估，以丰富对PIK3CA作为非小细胞肺癌治疗驱动基因的认识。

共招募了23名PIK3CA突变患者。共有14名男性和9名女性，平均年龄为61岁。吸烟者被分为曾经/现在(n =10)和从未(n = 13)。诊断时的病理分期为I期(9例)、II期(4例)和IIIA期(10例)。根据腺癌分类方案，主要亚型分别为实性(n =8)、腺泡(n = 4)、乳头状(n =3)、微乳头状(n = 6)和附壁型(n =2)。

表1：PIK3CA突变与非PIK3CA突变患者临床特征比较

表2：PIK3CA突变患者临床特征

表3：OS的单因素与多因素分析

遗传图谱为EGFR突变(401例，49.5%)、KRAS突变(65例，8.0%)、ALK融合(47例，5.8%)和PIK3CA突变(23例，2.8%)。PIK3CA突变位点位于外显子9 (n =14)和外显子20 (n = 9)。23例患者中有14例为E542K和E545K亚型。17个肿瘤同时具有EGFR突变(n =12)、KRAS突变(n =3)和ALK融合(n =2)的遗传异常。

图1：EGFR-TKI治疗单纯EGFR突变和EGFR/PIK3CA突变共存型PFS比较

图2：不同亚组RFS比较

图3：不同亚组OS比较

图4：单纯PIK3CA突变，EGFR/PIK3CA突变，KRAS/PIK3CA突变和ALK/PIK3CA突变OS比较

15例PIK3CA突变患者在切除后复发，包括单纯PIK3CA突变(n =4)和伴随基因异常(n = 11)。其中，9例接受了EGFR-TKIs(EGFR共基因，n=7；单纯PIK3CA突变，n=2)。在401例EGFR突变患者中，121例在复发后接受了EGFR-TKIs (单纯EGFR突变，n =110)。单纯EGFR突变患者的PFS比同时存在EGFR/PIK3CA突变的患者的PFS更长(10.7个月对6.0个月，P=0.092)。4名患者，包括单纯PIK3CA突变(n =2)和EGFR同时突变(n =2)，接受了依维莫司(一种mTOR抑制剂)。稳定(n =3)和进展(n = 1)。PFS中位数为3.5个月。值得注意的是，一名同时患有EGFR突变的患者从先前的吉非替尼治疗进展为吉非替尼和依维莫司治疗，并伴有6个月的PFS。

临床结果为复发(n = 502)和死亡(n = 415)。所有810名患者的中位参考值和操作系统分别为38.0 (95% CI:34.9–41.0)和49.1个月(95% CI:47.2–51.0)。5年的RFS为23.5%，OS为31.3%。他们被分为三组——PIK3CA野生型(n = 787)、PIK3CA并发型(n = 17)和PIK3CA单纯突变型(n = 6)。三组的中位RFS分别为36.5、27.0和14.0个月(P = 0.004)。PIK3CA野生型、PIK3CA并发突变和单纯PIK3CA突变的中位OS分别为49.6、41.1和26.0个月(P = 0.001)。单纯PIK3CA突变、EGFR/PIK3CA突变、KRAS/PIK3CA突变和ALK/PIK3CA突变患者之间无生存差异(P = 0.44)。晚期(III期)和PIK3CA突变与OS恶化显著相关。年龄、性别、辅助治疗或吸烟状况之间的OS无显著差异。多变量分析显示，PIK3CA突变和晚期是生存恶化的两个独立预后因素。

PIK3CA突变代表肺癌的一个子集，在中国人群中的患病率为2.8%。PIK3CA突变的状态可能影响EGFR-TKIs的临床疗效，并且PIK3CA突变可能是生存不良的预后因素。

研究八：ALK和ROS1基因融合特征与共存

肺癌是中国癌症相关死亡的最常见原因。大多数非小细胞肺癌患者在初步诊断时已经进入晚期。在过去的三十年里，化疗一直是主要的治疗手段，但疗效有限。与单独化疗相比，基于分子靶点的非小细胞肺癌治疗策略已得到广泛应用，并取得了令人鼓舞的结果。

表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂目前被推荐为转移性EGFR敏感突变患者的一线选择。EGFR突变检测被常规推荐。间变性淋巴瘤激酶(ALK)和c-ros癌基因1 (ROS1)是非小细胞肺癌中两个最常见的重排基因。先前的研究表明，非小细胞肺癌中ALK和ROS1的频率分别约为3-7%和1-2%。尽管作为一种常见的检测方式，临床病理特征并未得到广泛认可，特别是对于ROS1重排，因为事实上仅报告了200例患者。然而，大多数以前的研究主要集中在临床特征和基因频率之间的关系。然而，免疫组织化学(IHC)标记和组织学亚型没有完全提及。此外，最近的几项研究表明，驱动基因可能同时发生。然而，他们中的大多数人关注的是EGFR相伴。对于ALK/ROS1共存的频率知之甚少。

众所周知，ALK/ROS1重排患者可受益于克唑替尼治疗。然而，基于荧光原位杂交(FISH)，它们几乎都具有ALK/ROS1重排。聚合酶链反应(PCR)已被批准为中国的标准检测方法，用于检测克唑替尼的疗效。本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的ALK/ROS1流行数据来检测732例肺腺癌患者的临床病理特征和基因共存。同时，对重排阳性的受试者检测ALK/ROS1抑制剂的疗效。

共纳入788例野生型EGFR肺腺癌患者，其中732例可用于ALK/ROS1重排检测。56例患者因福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)质量差而未检出。共有391名男性和341名女性，年龄中位数为59岁[28-81岁]。323名患者有吸烟史，409名患者从不吸烟。他们在最初诊断时都没有接受过任何有针对性的治疗。临床分期：晚期219例，Ⅰ期205例，Ⅱ期112例，Ⅲ期196例。

表1：本研究患者临床特征

表2：不同基因突变患者临床特征

表3：ROS1融合患者临床特征

共有621名患者接受了组织学亚型评估。没有一例标本符合AIS标准，20例患者属于MIA。在601例浸润性腺癌中，占优势的组织亚型分别为乳头型165例(27.5%)、腺泡型148例(24.6%)、微乳头型103例(17.1%)、实性型91例(15.1%)、附壁型(14.0%)和变异型10例(1.7%)。并提供了604例TTF-1和Napsin A的详细结果，TTF-1和Napsin A阳性分别为509例和546例。收集545例患者的P63检测结果，其中520例为阴性，560例为CK5/6阴性，31例为阳性。

图1：ALK/ROS1融合频率基于免疫组化（左ALK右ROS1）

89例ALK阳性，32例ROS1阳性。ALK和ROS1基因频率分别为12.2%和4.4%。89例ALK阳性患者中，男性42例，女性47例，平均年龄49.5岁。有吸烟史者19例，不吸烟者70例。在32例ROS1阳性患者中，中位年龄为53.5岁，其中46.8%为男性。

实体优势亚型ALK和ROS1重排均明显高于其他亚型(P=0.006和0.015)。TTF-1阳性患者ALK和ROS1频率分别为13.8%和5.1%。在Napsin A阳性中，ALK和ROS1的频率分别为13.9%和5.1%。TTF-1阳性组ALK和ROS1重排频率明显高于阴性组(P=0.035.0 1和0.0 1)。在Napsin A阳性和阴性患者中也发现了类似的趋势。然而，CK5/6和p63的表达与ALK/ROS1频率之间没有这样的关系。RT-PCR检测89例ALK阳性患者中，FISH检测34例，阳性32例。643例ALK阴性患者中，FISH检测102例，阳性1例。在32例ROS1阳性患者中，有7例经FISH证实，均为阳性。

在89例ALK阳性患者中，33例在复发或转移后接受了克唑替尼治疗。在32例ROS1阳性的患者中，6例在晚期接受了克唑替尼治疗。ALK和ROS1患者的疾病控制率分别为87.9%和100%。ALK和ROS1阳性患者的客观有效率(ORR)分别为60.6%和83.3%。ALK阳性患者的中位PFS为9.5个月，ROS1阳性患者未达到。

图2：克唑替治疗ALK和ROS1融合患者PFS

2014年5月，一位56岁男性患者因呼吸困难就诊。影像学检查显示右上肺叶肿块伴肾上腺转移。肺肿块活检提示组织学为肺腺癌(部分印戒细胞癌)。EGFR突变状态为野生型。一线化疗方案培美曲塞和顺铂(PFS=5个月)之后是二线化疗方案多西他赛(PFS=2个月)。不幸的是，影像报告显示疾病进展，包括纵隔、锁骨上和腋窝淋巴结的参与。入组后，ALK/ROS1检测双阳性。FISH用于确认双ALK/ROS1重排的存在。Crizotinib(250 mg, bid)于2015年2月24日开始使用，2个月后影像学检查显示淋巴结有显著反应，随访至今Crizotinib的PFS已超过1年。

图3：克唑替治疗ALK和ROS1融合共存型患者治疗前与治疗后对比

在EGFR野生型患者中，ALK和ROS1重排的频率升高，ALK/ROS1共存的现象仍然极其罕见。ALK/ROS1基因的重排与年龄、吸烟状况、TTF-1和Napsin A的表达及实性优势腺癌亚型有关。

研究九：非腺非小细胞肺癌ALK，ROS1，RET融合特征

肺癌是中国癌症相关死亡的主要原因。大多数患者在诊断时已经达到晚期。对于晚期和转移性疾病患者，化疗是一种主要的治疗方法，其疗效已经接近6个月以下的无进展生存期。随着生物技术的快速发展，越来越多的癌基因被发现，靶向这些驱动基因的抑制剂显示出令人鼓舞的疗效。大约80%的亚洲肺腺癌患者至少有一种基因异常。最常见的基因包括表皮生长因子受体(EGFR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)和棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性两种主要类型的驱动基因是突变和重排。不考虑突变或基因重排，肺腺癌中普遍存在基因异常。目前，鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌和大细胞癌的基因异常，尤其是基因重排的患病率尚不清楚。对非腺癌中基因重排的研究很有限。在非腺癌非小细胞肺癌患者中没有明确的临床病理特征报道。此外，非腺癌患者被排除在大多数临床试验之外，因此靶向治疗的临床疗效尚不清楚。本研究检测了非腺癌非小细胞肺癌患者中ALK、ROS1和RET重排的频率，以评估其患病率、临床病理特征、治疗和预后。

共有385例患者被分为鳞状细胞癌(245例)、腺鳞癌(85例)和大细胞癌(55例)。在385名患者中，141例(26.6%)为未吸烟者，244例(63.4%)以前或现在吸烟。女性167例，男性218例，平均年龄58岁。病理分期为I期(147例，38.2%)，II期(56例，14.5%)和IIIA期(182例，47.3%)。

表1：融合基因非腺非小细胞肺癌临床特

表2：融合基因阳性与阴性患者临床特征对比

所有样本均成功检测到ALK、ROS1和RET基因。对于12名患者，ALK、ROS1或RET重排的检测频率为3.1%。最常见的基因重排依次为ALK(n=7)、ROS1 (n=3)和RET(n=2)。腺鳞癌、鳞癌和大细胞癌的发生率分别为8.2%、1.6%和1.8%。在385例患者中，212例进行了EGFR突变检测，包括鳞状细胞癌(105例)、腺鳞癌(72例)和大细胞癌(35例)。总共在26名患者中发现了EGFR突变。鳞状细胞癌、腺鳞癌和大细胞癌的EGFR突变频率分别为27.8%(20/72)、3.8%(4/105)和5.7%(2/35)。对于26例EGFR突变患者，未发现ALK、ROS1和RET的重排。12例患者中，腺癌(7例)、鳞状细胞癌(4例)和大细胞癌(1例)。8名男性和4名女性，平均年龄为49.5岁。3名患者有吸烟史，9名未吸烟。融合阳性患者比阴性患者更年轻且从不吸烟。然而，在性别上不存在群体间差异。

7例患者复发或转移，包括4例ALK重排(腺鳞癌，n=3；SCC，n=1)，ROS1(腺鳞癌，n=1；SCC，n=1)和RET重排(SCC，n=1)。6名患者接受姑息性化疗，1名接受支持性治疗。3名ALK重排患者，包括腺鳞癌(2名)和鳞状细胞癌(1名)，接受了克唑替尼治疗。这3名患者都实现了疾病控制，包括部分缓解(n=2)和稳定疾病(n=1)。值得注意的是，一名鳞状细胞癌患者取得了部分反应。3名克唑替尼患者的中位PFS为8.0个月。所有患者的中位OS为50.2个月(95% CI：44.0-56.5)，12名患者为36.7个月(95% CI：30.5-42.9)。有融合基因和无融合基因的患者之间无生存差异(36.7个月对50.2个月，P =0.21)。

图1：克唑替尼治疗前后对比

图2：融合基因阳性与阴性患者OS比较（P=0.21）

本研究首次证实了ALK、ROS1和RET基因在非腺癌肺癌中的比例。非腺癌肺癌的基因少见，发生率为3.1%，并与肺腺癌患者融合基因患者的临床病理特征相似。

研究十：ddPCR与ARMS在EGFR T790M检出中的对比

近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对具有致敏性EGFR突变的非小细胞肺癌患者具有临床疗效。八项随机试验表明，在接受一线TKI治疗的EGFR突变患者中，肿瘤缓解率明显更高，无进展生存期更长。然而，大多数患者最终对药物产生耐药性，并经历疾病进展。EGFR基因中的T790M突变被认为是获得性EGFR-TKIs耐药的最常见原因。这种T790M抗性突变在约50%从EGFR-TKI治疗的患者获得的再活检样本中发现。然而，在临床实践中，由于操作的侵袭性，在疾病进展后获得一系列肿瘤再活检是具有挑战性的，并且由于活检反映肿瘤异质性和遗传修饰进化的局限性，这也具有风险。多项研究表明，血浆中的肿瘤基因组具有同质性。此外，与分离的循环肿瘤细胞的分析相比，血浆中的突变检测在可及性、便利性和实用性方面显示出希望。使用基于PCR的定性分析，获得性TKI耐药的非小细胞肺癌患者血浆中T790MctDNA的检出率在30%至50%之间。因此，找到一种灵敏的检测方法是很重要的。我们首先使用ddPCR分析和ARMS分析来评估晚期非小细胞肺癌患者血浆中获得性T790M状态。目前，获得性T790M状态与患者临床结局之间的关系仍有争议。此外，本研究显示了EGFR T790M阳性和阴性患者的临床疗效和序贯治疗策略。

本研究中，从2014年12月至2015年12月，108名EGFR突变的患者对EGFR-TKI产生了获得性耐药性。70例患者外显子19缺失，33例患者外显子21L858R突变，5例患者外显子18G719X点突变。其中16例患者再次活检。平均年龄为57岁(范围为28-79岁)。男性、未吸烟者和腺癌患者的比例分别为50.9%、65.7%和94.4%。对于EGFR-TKI治疗，40.7%(44/108)的患者接受TKI作为一线治疗，59.3% (64/108)的患者接受二线或更多治疗。在这些患者中，83名接受了埃克替尼治疗，16名接受了吉非替尼治疗，5名接受了厄洛替尼治疗。其中，38名患者局部进展，34名患者逐渐进展，36名患者急剧进展。在获得对EGFR-TKI的耐药性后，38名患者接受了持续TKI治疗，25名患者接受了持续TKI加化疗，28名患者转而单独接受化疗。然而，有17名患者，在序贯治疗中没有获得他们的信息。

图1：患者T790M突变患者PFS1比未突变患者显著延长（P=0.010）

图2：患者T790M突变患者PFS2比未突变患者少许延长（P=0.709）

血浆T790M ddPCR与ARMS方法对比

本研究中，研究者分别应用ddPCR和ARMS分析来检测75份血浆样本中的EGFRT790M突变状态。经ddPCR检测，T790M突变率为46.7% (35/75)。然而，通过ARMS分析，T790M突变率仅为25.3% (19/75)。ARMS法在16份血浆样品中检测到T790M基因阳性，ddPCR法也检测到阳性(表2)。在19名患者中，只有1名患者的丰度低于5%(1.44%)，所有其他患者的丰度均高于5%(5.90-27.76%)。然而，在16名患者中，11名患者低于1%丰度(0.16-0.80%)，3名患者低于2%但高于1%(1.56-1.81%)，2名患者高于5%丰度(5.09-7.19%)。

血浆T790M ddPCR与组织ARMS方法对比

在此，研究者又使用ddPCR检测法，以配对肿瘤再活检中的T790M状态为标准，评估血浆T790M突变的检测灵敏度和特异性。在ctDNA中，T790M突变率为50.0% (8/16)。在肿瘤组织中，T790M突变率为56.3% (9/16)。在这些患者中，6例肿瘤组织和血浆中的T790M均呈阳性，5例两者均呈阴性。3例肿瘤组织T790M阳性，血浆阴性。另外两名患者血浆中的T790M呈阳性，但肿瘤组织中的T790M呈阴性。与肿瘤组织相比，ddPCR检测血浆中EGFR T790M突变的敏感性和特异性分别为66.7% (6/9)和71.4% (5/7)。

T790M ddPCR与临床特征

108例患者均用ddPCR从血浆ctDNA中检测。在这项研究中，47名患者T790M阳性，T790M突变频率为43.5%。70例EGFR 19缺失患者中，T790M突变率为44.3% (31/70)。21L858R突变33例，突变率为42.4% (14/33)。在局部进展组中，16名患者T790M阳性(42.1%)，22名患者T790M阴性(57.9%)突变。然而，在缓慢进展组中，突变型(55.9%)与野生型(44.1%)相比。相反，在爆发式进展组中，野生型的频率(66.7%)高于突变型的频率(33.3%)。

T790M ddPCR与获得性耐药

根据血浆T790M状态和TKI疗法，对所有108名患者的PFS1和OS进行了评估。然而，我们没有对17名患者进行后续治疗。在所有患者中，中位PFS1为12.3个月，中位OS为32.8个月。对于亚组分析，T790M阳性组的mPFS1比阴性组长(13.1对10.8个月，P =0.010)。同样，T790M突变患者的mOS为35.3个月，明显长于未突变患者的30.3个月(P =0.214)。另一方面，研究者又分析了PD存在T790M突变和不存在T790M突变的临床特征。他们发现T790M阴性突变患者肿瘤大小≥4厘米的发生率略高于T790M阳性突变患者(60.0%:40.0%，P =0.266)。远处转移的发生率相似(42.9%:43.8%，P =0.935)。三组之间的中位PFS1 (mPFS1)差异显著(P =0.006)。

爆发式进展组(10.4个月)的mPFS1短于缓慢进展组(12.8个月)或局部进展组(12.4个月)。接下来，研究者调查了91例PD患者的序贯治疗。PFS2的中位数为3.8个月(95%CI：2.709-4.631)。T790M突变患者的PFS2为4.0个月，与无T790M突变患者的3.1个月相比，差异不显著(P =0.709)。其中，38例接受持续TKI治疗的患者的PFS2为3.0个月，25例接受持续TKI加化疗的患者的PFS2为5.7个月，28例仅转用化疗的患者的PFS2为2.9个月。接受持续TKI加化疗组的亚组分析显示，T790M阳性患者的PFS2比T790M阴性患者长(6.0对4.3个月，P = 0.722)。在三组EGFR-TKI失败模式中，缓慢进展组(6.0个月)患者的PFS2长于爆发式进展组(4.9个月)或局部进展组(4.3个月)。

表1：EGFR T790M ctDNA患者临床特征

表2：EGFR-TKI治疗失败后对比ddPCR血浆检测与ARMS血浆检测T790M状态

表3：EGFR-TKI治疗失败后对比ddPCR血浆检测与ARMS组织检测T790M状态

表4：进展后序贯治疗PFS2

表5：进展后序贯治疗和T790M状态相关性

表6：进展模式与序贯治疗相关性

本研究表明，在对EGFR-TKI产生抗性后，ddPCR在相关的EGFR T790M突变中具有优势。随着第三代EGFR-TKI的研究进展，预计ddPCR可能具有良好的应用前景，并可能在获得性EGFR T790M突变患者中发挥越来越大的作用。

研究十一：ALK融合作为接受EGFR TKI治疗的耐药

EML4基因和ALK基因重排发生在2%-7%的非小细胞肺癌患者中。克唑替尼已在ALK阳性肺腺癌（ADC）中显示出令人印象深刻的单药活性。在ADCs中，对克唑替尼的客观应答率约为60%，中位无进展生存期近10个月。然而，众所周知，许多病例最终获得了对克唑替尼的耐药性。已经开发了几种第二代ALK抑制剂，目前正在临床试验中进行评估。它们已被证明对克唑替尼耐药患者有效，有效率分别为55%和56%。如今，原发性耐药的病例很少，因此这些患者对ALK抑制剂的原发性耐药机制尚不清楚。在这篇报道中，我们介绍了一例用埃克替尼成功治疗1例ALK重排转化为表皮生长因子受体(EGFR)突变的ADC患者。埃克替尼是一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，已经显示出对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(如吉非替尼和厄洛替尼)的治疗效果。在埃克替尼的IV期研究中，它在EGFR突变的患者中显示出良好的毒性和有效性。

一名49岁的女性，不吸烟，就诊时有1个月的咳嗽史。计算机断层扫描显示右肺有肿块和胸膜转移(T2aNxM1a，IV期)。使用针吸活检进行ADC细胞的病理诊断。苏木精和伊红(HE染色)显示ADC细胞的形态。免疫组织化学(IHC)分析显示甲状腺转录因子1 (TTF-1)、细胞角蛋白7(CK7)和Napsin A呈阳性，细胞角蛋白(CK) 5/6和P63呈阴性。通过ARMS检测肿瘤组织为野生型EGFR变异体。荧光原位杂交检测到ALK基因重排，ALK基因易位的分裂信号为21%。从2014年6月至2014年8月，患者接受了克唑替尼治疗(250毫克/bid，口服)。不良反应是可以忍受的。然而，这种治疗没有显示出疗效。胸部计算机断层扫描图像显示肿瘤大小和转移增加。根据实体肿瘤反应评估标准(RECIST)指南(1.1版)，此类肿瘤对克唑替尼的反应被归类为疾病进展。作为二线化疗，从2014年8月至2014年12月，患者接受了四个周期的化疗方案，即培美曲塞500 mg/m2 D1和卡铂(曲线下面积[AUC]= 5 D1–3)。疗效为稳定疾病(下降15%)。不幸的是，在常规检查中，CT扫描显示右肺出现胸腔积液表明2015年5月肿瘤进展。胸腔积液引流后胸腔积液无法控制。然后通过二代测序(NGS)在血浆中发现外显子19的缺失，并且没有发现其他突变，例如其他EGFR突变、BIM缺失、ALK融合或MET扩增。然后，患者在2015年6月接受了埃克替尼治疗(125毫克/tid，口服)。一个月后，胸部电脑断层扫描图像显示肿瘤尺寸减小。该应答被视为部分应答。在用埃克替尼治疗期间，未发现给药后的异常肝肾功能。没有与治疗相关的不良事件，包括胃肠道反应和皮疹。到目前为止，经过2个月，病情依然稳定。

图1：克唑替尼治疗前后对比

图2：细针穿刺HE和FISH（ALK融合）

图3：埃克替尼治疗前后对比

图4：EGFR 19del突变IGV图

本研究是国际上第一例通过NGS检测证实患者存在EGFR突变的报告，该患者在对克唑替尼产生耐药性后，对EGFR-TKI治疗产生了反应。

研究十二：ALK融合鳞状细胞癌接受克唑替尼治疗

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因，发达国家和发展中国家的发病率和死亡率都在上升。某些肺癌病例中特定的分子变化为开发新的靶向治疗提供了极好的机会。棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)重排在2-7%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中发现。但在鳞状细胞肺癌(SCC)患者中发现0-2.5%间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变的报道频率范围较低。新型ALK酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼在ALK阳性肺腺癌(ADCs)中已显示出令人印象深刻的单药活性。在ADCs中，对克唑替尼的客观有效率约为60%，其中位无进展生存期为近10个月。如今，参与临床试验的SCC患者比例较低；因此，ALK抑制剂对这些患者的疗效尚不清楚。本研究中，研究者介绍了一例成功的克唑替尼治疗鳞状细胞癌患者的ALK重排。

一名37岁从未吸烟的女性因一个月的咳嗽史就诊。正电子发射断层扫描显示左肺上叶和对侧纵隔淋巴结肿大(T2N3M0阶段，IIIB)为4.0×4.2厘米的肿块。通过针吸活检获得了鳞状细胞癌的病理诊断。苏木精和伊红(HE)染色显示了鳞状细胞癌细胞的典型形态。免疫组织化学(IHC)分析显示细胞角蛋白(CK) 5/6和P63阳性，CK7、Napsin A和甲状腺转录因子-1阴性。同步放化疗联合六个周期的多西他赛和顺铂(DP；多西他赛75毫克/平方米D1；从2013年7月至2013年11月，进行了顺铂 25 mg/m2 D1-3)化疗方案和三维适形放疗(每部分2Gy，每天1个部分，总放射剂量60Gy，每周5个部分，30个部分)。取得的疗效是部分反应。不幸的是，在常规检查期间，在CT扫描图像上右肺的多个转移的存在和右顶叶转移的存在指示了癌症的进展。ARMS方法检测EGFR野生型，IHC方法检测ALK阳性，患者于2014年6月接受伽玛刀放射外科治疗(总剂量24 Gy，50%等剂量，2个部分，2天)，然后于2014年7月接受克唑替尼治疗(250 mg/bid，口服)。两个月后，胸部计算机断层扫描图像显示肿瘤尺寸减小。根据实体肿瘤指南(1.1版)中的反应评估标准，该患者被认为对克唑替尼有部分反应。在克唑替尼治疗期间，未发现肝功能和肾功能异常。没有与治疗相关的不良事件，包括胃肠道反应、视力闪烁或心脏损伤。到目前为止，9个月后，病情保持稳定。

图1：放化疗及克唑替尼治疗前后对比

图2：细针穿刺HE和免疫组化

本病例表明，鳞状细胞癌患者可能存在EML4-ALK易位。因此，为了扩大克唑替尼治疗的适应症，建议对女性非吸烟者或任何对初始化疗方案无反应的患者进行ALK检测。