人类肠道病毒71型(EV71)为单正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起手足口病的主要病原体，儿童为主要感染人群。临床症状以发热以及口腔、手、足部的溃疡或斑疹为主，随着病情发展，可导致肺水肿甚至中枢神经系统疾患。目前尚无有效的治疗措施，揭示影响病毒感染的宿主因子，将有助于抗病毒药物的研发。　　一般病毒感染宿主细胞需经过吸附、入侵、脱壳、基因组和蛋白质合成、装配、释放这一完整的复制周期。其中，吸附和内吞是病毒侵入细胞的首要环节，病毒通常利用细胞膜上的受体和细胞自身固有的内吞途径侵入宿主细胞。P选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）和B族Ⅱ型清道夫受体2(SCARB2)是EV71的两个功能性受体。病毒与受体结合后，可激活细胞内相关信号转导通路;启动病毒的细胞入侵事件。病毒的细胞入侵途径具有多样性，病毒通常可以利用多种内吞途径侵入不同的甚至同一种靶细胞，其中，网格蛋白介导的内吞途径和小窝蛋白介导的内吞途径最为常见。此外，也有病毒依赖非网格蛋白或非小窝蛋白介导的内吞途径进行细胞入侵。　　EV71的传播以粪-口途径最广，在此传播途径中，肠道是人体抵御病原体的第一道屏障。动物实验结果表明，EV71经口腔接种小鼠后，最先在小肠组织表现出病原体阳性。因此，EV71很可能首先通过对肠道系统进行感染，在小肠道细胞内大量快速复制，随后入血导致病毒血症并引发其它器官的感染。目前，关于EV71感染人肠道细胞的入侵机制尚不清楚。　　本课题旨在探明EV71如何利用细胞的固有元件入侵人肠道细胞，以及病毒入侵是否会增加人肠道上皮细胞的通透性、是否会破坏细胞间紧密连接结构。选用人结肠癌细胞Caco-2作为EV71感染的靶细胞，通过免疫印迹、实时荧光定量PCR及小RNA干扰等技术，进行病毒受体的鉴定。利用人膜转运相关分子的小干扰RNA文库，对影响病毒感染的关键宿主因子进行高通量筛选。结合筛选结果，采用小RNA干扰、化学抑制剂作用和过表达显性抑制突变体等方法，确定EV71对Caco-2细胞的入侵机制和入侵相关信号转导途径。同时，建立Caco-2细胞单层体外培养模型，模拟小肠刷状缘上皮结构，探索EV71病毒入侵对肠上皮细胞通透性及紧密连接结构的影响。　　一、SCARB2是EV71感染Caco-2细胞的功能性受体　　人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）和人急性白血病单核细胞（THP-1细胞）分别作为SCARB2和PSGL-1表达的阳性对照细胞。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹技术对SCARB2和PSGL-1在Caco-2细胞中的表达水平进行检测，结果显示，PSGL-1基本不表达;而SCARB2高表达，其在Caco-2细胞表达水平与在RD细胞中相当。进一步利用小干扰RNA下调SCARB2的蛋白表达水平后， EV71对Caco-2细胞的感染与入侵被明显抑制。以上结果表明，SCARB2是EV71感染Caco-2细胞的功能性受体。　　二、EV71感染Caco-2细胞依赖的膜转运相关因子的筛选　　利用小干扰RNA文库，靶向下调140个人膜转运分子的表达，然后进行病毒感染。通过免疫荧光、图像分析及统计技术，分析各靶分子的下调对EV71的感染性的影响。结果显示，其中20个宿主因子的下调，对EV71感染抑制率达50％以上，这些宿主因子包括:DNM2、HGS、TSG101、VPS4A、VPS36、PIK3CG、BECN1、ARPC5、ENTH、EPN2、AP281、COPA、GAF1、GIT1、VAPB、VCP、NSF、RAB3D、RAB7B、RAB7L1。　　三、EV71感染Caco-2细胞不依赖网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径　　下调网格蛋白介导的内吞途径的几个关键分子CLTA、CLTB、CLTC和AP2A1后，并不能抑制EV71对Caco-2细胞的感染。通过网格蛋白抑制剂chlorpromazine作用、细胞内过表达EPS15蛋白显性抑制突变体(EPS15 DN)阻断网格蛋白介导的内吞途径后，也并不能抑制EV71对Caco-2细胞的感染。同样，敲低小窝蛋白介导的内吞途径的关键分子CAV1、CAV2和CAV3，并不影响EV71对Caco-2细胞的感染。通过使用化学抑制剂filipinⅢ和caveolin-1蛋白显性抑制突变体(CAV1 DN)阻断小窝蛋白介导的内吞途径后，也并不影响病毒对Caco-2细胞的感染性。以上结果表明，EV71感染Caco-2细胞不依赖网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径。　　四、EV71感染和入侵Caco-2细胞对化学抑制剂EIPA敏感，但并不依赖巨胞饮途径　　利用钠氢泵抑制剂EIPA阻断宿主细胞巨胞饮途径后，可抑制EV71对Caco-2细胞的感染和入侵。而下调其它几个参与巨胞饮的关键分子CDC42、RAC1、PKC和PAK1的表达，却并不影响病毒的感染性;Caco-2细胞经RAC1抑制剂NSC23766、PAK-1抑制剂IPA-3和PKC抑制剂bisindolylmaleimide处理后，病毒对细胞的感染性也未被明显抑制。结果表明，虽然EV71对Caco-2细胞的感染与入侵对EIPA敏感，但巨胞饮途径并不是病毒的入侵途径。　　五、发动蛋白(dynamin2)在EV71入侵Caco-2细胞过程中至关重要　　利用小干扰RNA下调发动蛋白（Dynamin2，DNM2）的表达，可显著抑制EV71对Caco-2细胞的感染与入侵。通过dynamin2抑制剂dynasore作用及过表达dynamin2蛋白显性抑制突变体(DNM2 DN)抑制dynamin2的功能后，可明显抑制EV71对Caco-2细胞的感染与入侵。在病毒感染入侵不同时间点，利用dynasore对细胞进行处理后，发现其对EV71感染抑制作用主要发生在病毒入侵早期阶段。结果表明，dynamin2对于EV71内吞入胞过程至关重要，其主要在病毒入侵早期阶段发挥作用。　　六、EV71对Caco-2细胞的感染与入侵需要胆固醇参与　　胆固醇剔除剂MβCD对Caco-2细胞进行预处理后，明显抑制了EV71对靶细胞的感染与入侵。将一定浓度的胆固醇添加到经MβCD预处理过的Caco-2细胞，另细胞胆固醇回到生理水平后，又可恢复EV71与EV71假病毒的感染性。在病毒感染入侵不同时间点通过MβCD处理细胞后，发现其对EV71感染抑制作用主要发生在病毒入侵早期阶段。结果表明，胆固醇参与了EV71感染与入侵Caco-2细胞，且主要在病毒入侵早期阶段发挥作用。　　七、EV71入侵Caco-2细胞依赖转运必需内体分选复合物相关因子HGS、VPS36、VPS37A、 VPS37C、 CHMP2A、 VPS4A　　利用小干扰RNA下调Caco-2细胞中转运必需内体分选复合物(Endosomal sortingcomplex required for transport，ESCRT)相关因子HGS、VPS36、VPS37A、VPS37C、CHMP2A和VPS4A的表达，可显著抑制EV71对Caco-2细胞的感染与入侵，提示ESCRT在EV71入侵Caco-2细胞过程中起作用。1，2-棕榈酰磷酯酰肌醇-3-磷酸（Phosphatidylinositol3-phosphate，PI3P）对于ESCRT在内体膜上的定位和多囊泡体(Multivesicular bodies，MVB)的形成非常重要，其产生主要由磷脂酰肌醇激酶PIK3CG催化介导。进一步通过小干扰RNA下调PIK3CG的表达、利用化学抑制剂wortmannin抑制PIK3CG活性后，发现EV71对靶细胞的感染与入侵均被明显阻断。结果表明，EV71入侵Caco-2细胞依赖ESCRT，在其参与下，病毒很可能随之被递呈至MVB。　　八、蛋白激酶A(PKA)与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在EV71入侵Caco-2细胞阶段发挥重要作用　　通过多种靶向细胞信号转导分子的化学抑制剂对Caco-2细胞进行预处理后，发现H-89（PKA抑制剂）和NSC-87877（SHP-2抑制剂）可以明显抑制EV71的感染与入侵，且高浓度的NSC-87877基本可以完全阻断病毒的感染与入侵。在病毒感染入侵不同时间点用H-89或NSC-87877处理细胞后，发现H-89主要在病毒感染起始阶段表现出明显的抑制作用，而NSC-87877仅在入侵中、晚期阶段发挥抑制功能。以上结果提示，细胞内信号分子PKA和SHP-2对于EV71入侵Caco-2细胞至关重要，且PKA主要在病毒感染起始阶段起作用;而在病毒入侵中、晚期阶段，SHP-2发挥着决定性作用，其发挥作用的靶点很可能是在病毒的囊泡转运或脱壳阶段。　　九、EV71入侵可改变紧密连接结构进而增加Caco-2细胞单层通透性　　利用transwell培养技术构建Caco-2细胞单层模型，通过检测细胞单层跨膜电阻值(TEER)及细胞间紧密连接对细胞单层的完整性进行评估。将EV71病毒加入Caco-2细胞单层持续感染2h，检测TEER值的变化，利用免疫荧光对ZO-1进行染色，确定紧密连接是否发生变化。结果显示，细胞单层跨膜电阻值TEER降低了50％以上，细胞间紧密连接结构发生重排，呈非连续性分布，提示EV71对分化成熟的Caco-2细胞单层进行入侵时，可造成紧密连接的改变，进而增加细胞单层通透性。　　本课题初步阐明了EV71入侵人肠道细胞的分子与细胞机制，加深了对EV71复制周期的理解和认识，为抗病毒药物的研发提供了新的靶点。