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寡核苷酸药物（Oligonucleotides，ONs）是由人工化学合成的寡核苷酸单链或双链组成的一类药物，通过碱基互补配对作用于mRNA，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，使编码异常的基因丧失功能，进而阻止“错误”蛋白质的表达，从而发挥基因水平上调控疾病基因转录翻译过程的独特机制。

由于寡核苷酸药物独特的化学结构，表现出较差的成药性：分子量较大、亲水性强、高度负电性、不遵循Lipinski’s原则，并且药代特征也较差、无法通过生物膜，还会有脱靶效应。随着Mipomersen于2013年获得FDA批准用于治疗纯合子型家族性高胆固醇血症（HoFH）的治疗（现已撤市），验证了寡核苷酸药物可以应用于眼科之外的领域，也开启了基于寡核苷酸药物的基因治疗时代，为基因治疗领域的发展带来了巨大的机遇。

一些罕见、疑难疾病，如杜氏肌营养不良、乙型肝炎以及成人遗传性转甲状腺素蛋白（hATTR）淀粉样变性引起的周围神经病变等，采用传统的治疗手段无法得到有效的治愈，而寡核苷酸药物可以从源头干预，达到标本兼治的效果，为患者增加了用药选择。寡核苷酸药物与传统的以蛋白为靶标的药物相比，更具有特异性和高效性，有望填补以蛋白为靶标的药物治疗领域。随着技术的进步，适应症已扩展到慢病的治疗，比如LEQVIO是2020年EMA批准的小干扰RNA（siRNA），用于降血脂，一年2针。

本文将从寡核苷酸药物的分类、结构特点、化学修饰和递送系统、获批药物、药代动力学特征、免疫原性研究、安全性研究、相关法规/指导原则、生物分析策略和实例分享几个方面进行阐述。

分类及结构特点

寡核酸药物包括反义核酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、核酸适配体（aptamer）、核酶（ribozyme）等。其中ASO和siRNA类型的寡核苷酸药物应用广泛。

单链的ASO是由10~30个核苷酸组成，双链的siRNA有20~25对碱基，Aptamer一般由15~30个核苷酸组成，分子量较大，单链通常是4~10kDa，双链的siRNA可达20 kDa（通常6~14 kDa），如表1所示。

表1 寡核苷酸药物的特点[Shalini A , et al, 2018]

化学修饰和递送系统

未经修饰的寡核酸带负电、极性大、水溶性强（在中性和碱性环境下）、不易通过脂质双分子层和血脑屏障等生物膜，分布特性差；稳定性差，在细胞外液中易降解，易被肾脏和肝网状内皮系统（单核吞噬细胞, 肝窦状内皮细胞、库弗氏细胞）清除；对靶点的亲和力差，易脱靶等特点，所以，需要借助化学修饰或者递 药系统改善成药性。

化学修饰化学修饰对抵抗核酸酶的降解尤为重要,对于反义寡核苷酸的修饰主要基于3个方面（如图1所示）：（1）对磷酸骨架的修饰；（2）对糖的修饰（尤其对核糖的2’位修饰）；（3）对碱基的修饰。通过修饰，可提高药物对核酶的抗性，增加与mRNA的结合力，减少毒副作用。目前为止，反义寡核苷酸已经从第一代发展到第三代。 硫代磷酸酯寡聚脱氧核糖核酸是第一代的主要代表，在这一类寡聚核苷酸中，磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子，PS骨架的修饰减少了寡核苷酸的亲水性、增加了对核酸酶降解的抵抗力以及增加了其与血浆蛋白结合进而使得寡核酸稳定性增加，减少肾小球滤过到尿液中排泄。PS骨架的改造虽然改善了部分PK特性，使其系统暴露增加，进而增加细胞摄取和转运，但是单一的PS骨架修饰不能保障寡核苷酸不被酶降解，并且在高浓度时这种修饰降低了寡核苷酸和靶标的亲和力，使机体产生炎症反应。

为了进一步增加靶标结合亲和力、抵抗核酸酶降解、减少促炎症反应，出现了具有糖基修饰的二代寡核苷酸药物。 第二代寡聚核苷酸以硫代反义寡核苷酸序列为核心，在核糖的2'羟基换成烷基修饰，2'-O-甲基和 2'-O-乙基是这类修饰的两个重要成员，还有2'氟。 2'-O-Me的修饰提高了靶标亲和力、核酸酶降解的抵抗力以及减弱PS骨架引起的免疫刺激性，2'-MOE在反义寡核苷酸药物中应用最多； 而siRNA 广泛应用2'-F或者2'-O-Me修饰。

第三代以PMO（吗啉）修饰为代表，序列特异性强、细胞内活性高且可预测、极少或没有非反义活性（抑制细胞粘附、生长，干扰病毒复制，刺激B细胞和单核细胞产生细胞因子等）、水溶性好、抗核酸酶活性高、成本低。FDA批准的10个反义寡核苷酸药物中有4个为吗啉代寡核苷酸类型。

尽管化学修饰提升了药物的稳定性，但是同时降低了药物与靶点的亲和作用。此外，药物到达靶点发挥作用前，会与复杂的通路中的各种蛋白发生作用，以对靶点抑制靶点基因。也就是说药物到达靶点发挥作用，不仅需要药物具有良好的组织分布特性、良好的清除特性，和相关通路蛋白的相互作用也是极其重要的因素。

图1 在反义寡核苷酸药物中常见的化学修饰[C. Frank Bennett, 2019]

递送系统

核酸药物除了需要通过化学修饰延长与靶点的作用时间、增加与mRNA的结合力外，还可通过递送系统的帮助进入靶细胞，从而免于被肾脏排泄和核酸酶降解，减少毒副作用。 对于递药系统，近年来，N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）偶联寡核苷酸药物的应用居多。 比如，分子质量〜14kDa 的双链siRNA因为具有较大分子的体积和亲水性，经细胞摄取有限。 为了增加细胞摄取，siRNA通常连接靶向配体，比如N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）或包裹在脂质纳米粒中进行靶向递送。 获批的5个siRNA中，其中有4个为经N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）修饰。 此外，以脂质体、与其它带正电荷带多肽、高分子等形成纳米粒、外泌体等为代表的纳米递送系统以及AAV载体也均有应用，如图2所示。 采用脂质体纳米粒制剂作为递药系统的Patisiran可将药物靶向递送至肝脏，做成脂质纳米粒后增加肝细胞对药物的内吞摄取作用。 但Patisiran脂质纳米粒制剂会引起促炎症反应。 所以，直接连接靶向配体的siRNA递药策略似乎更有发展前景。 此外，寻找靶向肝外组织的配体前景广阔。

图2 核苷酸药物的递送系统[T.C. Roberts, et al., 2020]

获批药物

得益于过去20 年化学和生物技术的发展，一些关键技术难题被攻克，全球迎来核酸类药物研发热潮。从1998年至今，全球共有16个寡核苷酸药物获批上市，其中包括10个ASO、5个siRNA和1个适配体，基本信息如表2所示。

表2 全球获批寡核苷酸药物的基本信息

（表中数据来源于FDA、EMA，由阳光德美整理制图）

药代动力学特征

寡核苷酸药物的生物化学和生物物理特性是影响这类药物药代动力学特点的基本因素，不同于化学小分子和单抗药物，具有独特的药代动力学特点，表3汇总了全球获批的寡核苷酸药物的药代动力学特征。

表3 获批的寡核苷酸药物的药代动力学特征[FDA，EMA]（表中数据来源于FDA、EMA，由阳光德美整理制图）

细胞摄取和转运

单克隆抗体药物通常和细胞外的可溶性靶标或者细胞表面的靶标结合发挥治疗作用，而寡核苷酸药物必须进入细胞才能发挥药理作用。 药物与细胞表面的蛋白结合，会从血浆中迅速清除，使其直接分布于血管外，被组织摄取，然后，通过组织细胞内吞内化至核内体，继而从早期核内体中释放出来，进入细胞质或细胞核靶向mRNA，发挥药效或产生毒性。 进入组织中的药物会通过核酸内切酶和核酸外切酶代谢为不同尺寸的、更小的片段。 完整的或者更小的片段借助于细胞膜渗透、囊泡释放或者外泌体释放尿道中（如图3所示）。

图3 寡核苷酸药物体内过程（以ASO为例）[Julia M. Migliorati, et al, 2022]

寡核苷酸药物的细胞内化过程包括“有效途径”和“无效途径”，如图4所示。“有效途径”依赖于非巨噬细胞的胞饮作用和内含体的胞内分布作用，从内含体逃逸出来的药物进入细胞质或细胞核内发挥药理作用；“无效途径”依赖于巨噬细胞的胞饮作用，该途径会导致药物聚集在溶酶体中被降解或清除。进入胞内的大部分药物经吞噬作用通过“无效途径”导致药物聚集在溶酶体中被降解或清除。仅少部分经释放、或被胞质和/或细胞核摄取，最终到达靶RNA。在内含体中有很多和先天免疫相关的Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）当TLRs识别进入内含体的药物，可能会引起干扰素和其它细胞因子的激活，进而产生促炎症反应的副作用。

图4 反义寡核苷酸药物摄取进入细胞膜的有效途径和无效途径示意图 [Geary R S , et al. 2015]

吸收和血浆PK特征

口服吸收较少，须经非肠道途径给药。主要通过皮下或者静脉输注给药，有少量报道经口服给药方式；还可以从玻璃体内或鞘内等局部注射实现局部治疗。吸收迅速快，通常2～6h达峰。

二代ASO血浆PK呈现多相消除的药代特点（如图5所示）。药物从循环转运至组织的过程较快，分布半衰期较短，从0.5～3小时，药时曲线上表现为血药浓度迅速下降，快速分布至组织。静脉给予二代ASO药物药后，血药浓度在给药后4～6小时降低10～20倍，24小时内降低2～4个logs数量级的变化。药物被摄取至组织细胞后，在组织中的处置过程极为缓慢，此时血药浓度非常低，在组织中消除半衰期可达2周至2个月，体现在药效上是和靶点的作用时间较长。药物在血浆中的末端消除半衰期可以代表其在组织中的消除半衰期，反映了组织中药物向血浆室的再分布，即药物从组织细胞向细胞外液和血浆室的缓慢转移的过程。与血浆分布相比，通常，寡核苷酸药物分布至胞内所需时间长，使得它们起效较慢，因此PD应答与药物浓度之间通常有一段滞后。

由于寡核酸药物在组织中的半衰期长，通常按周、月甚至按年给药。2020年获批的siRNA lumasiran先是按每月一剂后每三个月一剂，大大增强了患者的依从性。并且，通常寡核苷酸药物靶部位达稳达时间比较久，推测lumasiran在肝脏达稳达时间长达3个月。

图5 静脉给予ISIS 104838后的血药浓度曲线[Yu R Z , et al., 2013; Geary R S , et al., 2015]

多次给药后，药物在体内几乎没有蓄积现象，可能主要是由于药物会快速广泛地从血浆分布至组织中，在组织中缓慢发生代谢。寡核苷酸药物到达体内稳态浓度较慢，药物在组织中达到稳态时谷浓度才会积累。组织中药物达到稳态浓度依赖于给药频次和药物本身需具有较长的组织消除半衰期。比如，组织消除半衰期（可以通过血浆后分布相估算）为2周到4周的药物，血浆谷浓度需要2到4个月才可能达到稳态（假设没有loading dose的情况下），可采用负荷给药方式，可缩短药物达到稳态的时间，但是在负荷期可能会出现剂量限制性毒性，如图6所示。

图6 重复皮下给予mipomersen后的血浆谷浓度（Mean ± SE）[Akdim F, et al., 2011]

Dose regimen I：2-week dose-loading后，每隔一周给药一次，给予11周；Dose regimen II：每周给药一次，给予13周（400 mg/week剂量组是给到10周）

在一定的剂量范围内，寡核苷酸药物在血浆中呈线性动力学特点，随剂量的进一步增加，出现非线性动力学特点，呈现代谢饱和。皮下注射药物峰浓度较静脉注射的峰浓度低，尽管同样剂量的皮下注射和静脉注射的血浆动力学有差异, 但靶器官中的浓度却几乎相等。寡核苷酸药物的PK特征和核苷酸的一般理化性质、化学修饰、递药系统、偶联物性质密切相关，大多与核苷酸序列无关，比如2'-MOE修饰的几种理化性质相近的反义寡核苷酸药物，它们的PK行为在大鼠、犬、猴、人中较为一致，如图7，图8所示。

图7 种属间类似的PK行为[Richard S Geary, 2009]

图8 种属间稳态下的血浆AUC 和清除率 (CL/F) (mean ± SD) 对mg/kg剂量 (a和c) 或对mg/m2剂量 (b和d)[Yanfeng Wang, et al, 2019]

寡核苷酸药物通过组织向血浆再分布的过程中，血浆和肝脏的药物浓度一般成相对固定比例。有报道，二代ASOs的后分布血浆药物浓度和肝脏药物浓度比约为1:6000，这一比例在不同种属间保持一致（如图9所示），提示可以通过检测到的血浆药物浓度，推算药物在肝组织的暴露水平。基于组织中药物浓度、谷浓度和血浆后分布浓度的相关性好这一特点，有助于构建PK/PD模型，阐明暴露-效应关系，制定给药方案。

图9 两种不同序列同样的 2′-MOE嵌合结构表现为不同的肝肾半衰期，具有相同的 肝脏:血浆药物浓度比值，且随着时间的变化，比值恒定[Richard S Geary, 2009]

ASOs在不同种属间的暴露和清除率与体重相关（BW，mg/kg），而非体表面积（BSA）。食蟹猴的清除率可按照体重（mg/kg）1：1推测人的清除率；啮齿类动物的清除率比人高5-10倍（mg/kg）（scaling factor 为7），如图8和10所示。比如连接N-乙酰半乳糖胺链接后增强了肝细胞的靶向性，在临床相关剂量时，猴按体重外推人的清除率是1：1的关系；如果根据体表面积（BSA）计算，猴的清除率大约是人清除率的30%～50%。而鼠的清除率按照BSA推测人的清除率更准确一些。采用BW，小鼠的清除率大概是人清除率的10倍。

图10后分布相血浆药物谷浓度水平与猴组织中药物水平保持平衡[Richard S Geary, 2009]

siRNA药物从血浆室快速清除，血浆末端半衰期较短（3天，Patisiran）需要通过化学修饰如GalNac-siRNA或者利用脂质体递送，可延长清除半衰期可达数周，支持临床以数周或季度频率给药需求。

分布和组织暴露

系统给药后，寡核苷酸药物可在除中枢神经系统外的各组织广泛分布，主要分布于肝脏、肾脏、脾脏、骨髓和骨骼肌等。 分布到肝组织的细胞类型是非实质性细胞如库普弗细胞（Kupffer cell）和内皮细胞，仅有不到15%分布至肝细胞，而肝细胞占肝总体积的80%，可见，仅仅基于检测组织中的药物浓度并不能评估靶细胞中的药物水平。

关于寡核苷酸药物的表观分布容积的计算问题，由于是基于血浆分布相的数据进行计算，可能低估了该数值。因为当药物主要从外周室进行消除时，标准的非房室模型的方法会低估分布的程度。

充分了解寡核苷酸药物的血浆蛋白结合率非常必要，因为血浆蛋白结合率关乎药物的组织分布和肾清除率。含硫代磷酸骨架的药物具有较高的血浆蛋白结合率，达90%；N-乙酰半乳糖胺修饰的ASO与未修饰类似，同样具有高达98%的血浆蛋白结合率。尽管经过化学修饰具有良好的代谢稳定性，吗啉代ASO药物的血浆蛋白结合率较低，如Eteplirsen的蛋白结合率低至6.1%〜16.5%，但同时，24h内其肾脏排泄清除率可达60%〜70%。此外，siRNA的蛋白结合率从2.1%到90%不等。血浆蛋白结合率高使得药物避免被肾脏快速清除，促进组织细胞对药物的吸收。

寡核苷酸药物与血浆蛋白结合是通过非特异性低吸附作用结合于亲水位点，而非极性小分子化学药物通常结合于白蛋白的疏水位点。寡核苷酸药物和化学小分子药物血浆蛋白结合位点的差异，使得两者不太可能因血浆蛋白结合位点的竞争而引起药物相互作用。同时，寡核苷酸药物发挥作用下的血浆暴露水平为μM水平，远低于血浆蛋白浓度水平，引起血浆蛋白的药物药物相互作用的可能性较小。

代谢

寡核苷酸药物主要通过血浆和组织中的核酸酶，包括核酸内切酶和核酸外切酶，进行广泛而缓慢的代谢。 血浆中主要依靠核酸外切酶（尤其是3’-外切酶活性），细胞内主要依靠核酸内切酶。 核酸内切酶会先将药物裂解成小的核酸片段，然后核酸外切酶从药物的3’和5’端进行水解。 硫代ASO的主要代谢产物为3’端去掉一个碱基，然后核酸外切酶进一步将药物剪切，使其失去2个碱基，以此类推，如图11所示。 通常，二代ASO的外切酶代谢产物较少，而更多的是通过内切酶裂解掉更短的核苷酸碎片。 代谢产物的生成比较慢，同时消除又比较快，使得其血浆中的暴露水平相对较低。 N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）结合的ASO在血浆中具有良好的稳定性，类似前药。 一旦被摄取进入组织后会释放ASO，3个GalNAc糖链会被溶酶体水解酶（N-acetyl-β-glucosaminidase）一个接着一个水解掉，该过程较快，可能仅发生在几分钟内。 此外，由于种属间DNA和RNA的结构和功能较为保守，核酸酶的功能和底物的特异性也较为保守，所以种属之间代谢产物结构的差异并不大。

图11 2′-MOE修饰的反义寡核苷酸药物的代谢途径示意图[Richard S Geary, 2009]

不同于小分子药物主要是通过CYP450酶发生代谢，寡核苷酸药物主要通过核酸内切酶和核酸外切酶进行代谢，核酸酶广泛地表达于各种组织脏器。所以，肝功能不全患者通常也较少会引起寡核苷酸药物总体清除率的变化。由于寡核苷酸药物不太可能是细胞色素P450酶和转运体的底物；同时，这类药物也不会直接抑制或者诱导CYP450，所以，直接基于代谢酶和转运体引起相互作用的可能性较小。但是也要根据药物的作用机制加以关注，比如ALAS1靶点抑制剂Givosiran会降低肝血红素的含量，进而会降低CYP450酶的作用，所以这个药物会增加CYP1A2/2C9/2C19/2D6/3A4底物的血浆暴露。此外，IFN-a、IL-6等细胞因子可调控某些CYP450酶的表达水平。所以，要根据药物的作用机制来全面评价这类药物的相互作用，以及对联合用药代谢的潜在影响。

排泄和物质平衡

寡核苷酸药物的排泄较为缓慢，全部排泄完全需要几周到几个月的时间，主要以原形或小片段形式主要经肾排泄。 不同结构寡核苷酸药物的主要排泄途径和排泄形式不同，如硫代修饰的和2′-O-甲基修饰的寡核苷酸药物排泄物多为3′核酸外切酶的降解产物，原型药较少，主要排泄途径为尿； 吗啉代通常以原型形式通过尿排泄； 硫代修饰的比2′-O-甲基修饰的排泄速率快； 某N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）结合的ASO在动物体内的研究结果表明，约25%以GalNAc簇的极性代谢产物的形式排泄至尿中，大于70%相对脂溶性的代谢物通过粪便进行排泄； siRNA少部分原性药物经尿排泄，给药后24h内，尿中排泄的量仅占非常少的量，大部分药都被摄取进入组织了。

由于寡核苷酸药物的消除半衰期过长，限制了采用常规手段开展其物质平衡研究，临床上也较少开展该类药物的物质平衡研究。上市寡核苷酸药物中仅2021年FDA批准Casimersen进行了人体物质平衡研究，结果表明，该药92.1%都是通过尿液进行排泄。此外，有报道显示肾损人群随肾功能的严重程度清除率降低，血药浓度升高，但是是短暂性的，不会影响整体的给药方案。需要关注肾损人群的药物的清除率和血浆暴露情况，综合评判是否需要针对特殊人群进行给药方案的调整。

免疫原性研究

ADA的评价通常是在治疗早期进行评价，比如3个月或者更早。ADA的研究结果表明，在寡核苷酸药物的临床相关剂量下，免疫原性对PK的Cmax和AUC暴露影响较小。免疫原性阳性的动物血浆谷浓度水平高于阴性的动物，但血浆暴露水平高并没有增加组织的暴露，所以免疫原性对PD指标没有影响。所以推测，抗-反义寡核苷酸药物抗体属于结合型抗体，非中和活性的抗体。

安全性研究

基于寡核苷酸药物的作用特点，Oligonucleotide Guidline将寡核苷酸的毒性分为①靶向毒性，为靶点相关的药理学活性放大所引起的毒性反应；②杂交依赖的脱靶毒性，即与靶序列相似的序列杂交而产生的脱靶效应；③非杂交依赖的脱靶毒性，即不依赖于杂交，由寡核苷酸分子的结构和物理/化学性质所引起的脱靶毒性。

核酸药物直接作用于靶基因，阻断mRNA分子翻译成蛋白质。寡核苷酸药物有许多不同于小分子药物的独特PK特点，同样也有独特的毒副作用。虽然寡核苷酸药物具有不同的结构、不同的给药方式、不同的作用靶点和组织，但仍表现出一些共同的副作用，比如都有注射部位的反应；还有反应是作用于免疫系统产生的副作用，比如头痛、发烧；呼吸系统感染引起的咳嗽；胃肠道系统表现的恶心、呕吐。其中，比较常见的副作用如头痛、发热、流感样症状、腹痛、恶心、乏力等，可以通过非处方药的干预自行缓解。最主要的安全性问题是严重的肝毒性、肾毒性和过敏反应，如表4，图12所示。尤其肾毒性的发生率比较高，所以在采用ASO治疗时，检测肾功能尤为关键。如果出现过敏反应，则需要停药。靶向肝脏某些基因的表达会引起ALT和AST升高、以及脂肪肝相关的肝毒性。Mipomersen上市五年后于2019年撤市，主要是由于它的肝毒性。

表4 FDA批准的反义寡核苷酸药物中常见的毒副作用[Feryal Alhamadani, et al., 2022]

图12 FDA批准的反义寡核苷酸药物中警示具有毒性的药物[Feryal Alhamadani, et al., 2022]

ASO产生肝毒性主要通过2种可能的机制，一个是杂交依赖的脱靶效应或者RNAse-H1酶依赖性降低引起的脱RNAs靶效应。前者发生在ASOs和与靶标RNA有同源序列非特异RNA互补结合的过程；ASOs的肝毒性可能由后者介导的。

ASO的肝毒性可能与内质网应激有关，从而导致药物性极低密度脂蛋白降低，增加了肝脏脂肪变性（Hepatic steatosis）。肝脏Kupffer细胞和肾脏近端肾小管上皮细胞有高浓度的药物分布时，肝脏会表现增加细胞质空泡形成和激活促炎性通路的发生率。

ASO肾脏毒性的可能机制是药物在肾近曲小管溶酶体中的累积所致，这与ASO在细胞外的、细胞表面的或者细胞内的蛋白发生离子相互作用有关。多次给药使药物积累后达到稳态浓度水平，毒性则决定于药物浓度的高低和内在的ASO蓄积的能力。

相关法规/指导原则

寡核苷酸药物的临床药理学研究可参考FDA颁布的指导原则，Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry, FDA, 2022.06 (Draft Guidance)。可以遵循小分子药物研发的相关法规，如ICH M3（R2）。可利用临床前长毒的样本研究其生物转化方面的数据，临床多次给药研究阶段可以开展详尽的跨种属的代谢转化研究，较早开展该方面研究有助于掌握活性代谢产物以及潜在脱靶的代谢产物的体内特征。

生物分析策略

样品的前处理技术

寡核苷酸药物的结构特点及药代特点，如水溶性强、高度负电性、血浆内浓度跨度大、血浆后分布相浓度低等，给生物分析带来了巨大挑战。 在分析前需要对含寡核苷酸药物的生物样品进行前处理，主要有液液萃取法（LLE）、蛋白酶K消解、固相萃取（SPE）、磁珠杂交提取法。

1、液液萃取法（LLE）

液液萃取法常用的萃取试剂是苯酚和氯仿。 该法可以在破坏细胞膜释放细胞内的寡核苷酸药物的同时维持药物的溶解性。 随后加入氯仿分层，通常，上层水层中含有RNA、siRNA和寡核苷酸药物，有机层中含有DNA。 药物具体分布于哪层需依据药物性质。 比如，虽然硫代寡核苷酸药物疏水性更强，但是它仍旧分布于水层，除非其疏水性极强的情况下分布于有机层。 修饰较少的siRNA或者miRNA药物也偏向分布于水层。 所以，具体实验时，最好同时分析水层和有机层，以免不可预见的情况发生。 可以加入促溶剂、金属清除剂、助溶剂等，可提高方法的提取效率。 LLE法的优势之一是可以确保不损失代谢产物。

2、蛋白酶K消解

蛋白酶K是一种通用的蛋白酶。 该法通过酶解的方式去除蛋白干扰。 在消解的过程中需要维持生理pH和温度。 可以加入二硫苏糖醇破坏蛋白的二硫键，增加蛋白酶K的效率。 氯化胍的加入会使蛋白变性，增加蛋白的降解效率。 在蛋白消解的过程中为了保证寡核苷酸药物的稳定性，可以加入与金属离子络合的EDTA以抑制核酸酶。 该法可以较大程度地降低样品的转移步骤。 转移次数的增加会非特异性吸附增加，尤其对低浓度样品的影响程度较大。 该法可以应用于多种寡核苷酸药物生物样本的制备，回收率达90%。 且该法需要搭配其它样品前处理方式，如液液萃取，才能较好地排除杂蛋白的干扰。

3、固相萃取（SPE）

固相萃取法通常采用弱阴离子交换（WAX，如Clarity OTX cartridge）或者亲水-亲脂填料（如HLB），前者利用酸保留、碱洗脱原理，提取效率较高； 后者基于反相离子对色谱的原理。 通常，寡核苷酸样品上样是在pH值为5.5的缓冲液条件下，先对药物进行强保留。 采用相对强的溶剂，如1:1的pH值为5.5的缓冲液和乙腈或者甲醇去除其它内源性物质的干扰。 洗脱时pH值为9.5，采用1:1的乙腈和四氢呋喃作为洗脱溶剂（如图13所示）。 SPE的回收率可以达到60～80%，通量较高。 SPE通常可以和苯酚-氯仿萃取、乙醇沉淀联合应用，LLE和SPE两步法对色谱柱较为友好，且背景信号低。

图13 SPE固相萃取-液质联用法进行寡核苷酸药物生物分析的前处理流程[ Bartlett et al., 2019; James Michael Sutton, et al., 2019]

4、磁珠杂交提取法

磁珠法可通过靶向和非靶向两种方法实现样品的分离和制备。 靶向法通常需12～15个碱基、与待测物互补结合的、生物素化的捕获链。 生物素可以与链酶亲和素磁珠结合，以此特异性地分离目标物。 该法的缺点是无法克服代谢产物带来的干扰。 此外，由于该法的特异性，使得其限制制备过程中内标的使用。 同时，该法需要为每个分析物定制捕获探针，且受限于固相载体的容量，动态范围不如LLE和SPE宽。 示意图如图14所示。 非靶向法采用离子交换磁珠法，通用性更强，样品中需要加入弱酸以最大化保持磷酸骨架的负电性。 加入非离子表面活性剂可以提高洗涤效率，如吐温； 不可用离子表面活性剂，如十二烷基硫酸纳、Triton X‐100，避免它们与药物竞争结合磁珠表面。 磁珠法可降低样品的转移次数，避免非特异性吸附，回收率可达80～95%。 但因为操作过程中需要孵育，整个实验操作耗时达5～6小时。

图14 磁珠杂交提取法的样品制备过程[Pei Li, et al., 2020]

5、在线捕获柱法

该法通常采用C18柱，同样可以减少样本的转移次数，通过在线富集，去除样品中低分子量的干扰物，直接进质谱分析。该法可以与SPE法联合使用，以提高方法的选择性。但该法操作较为复杂，且需要选择合适的C18柱用于待测物的富集。

分析技术

寡核苷酸药物的分析方法有很多，不同的分析技术在定性、定量等不同场景中各有各的优势和不足，如表5所示。 QWBA能够快速直观地检测药物在所有组织中的分布情况，结果清晰明了，但无法区分代谢产物和原型药，检测灵敏度不高，并且样品制备过程非常繁琐，通量低。 HPLC和毛细管电泳技术用于生产质控环节或者是结构表征，灵敏度低、样品制备复杂，毛细管电泳技术方法的重现性差。 而液质、杂交法、qPCR法在PKPD等药性评价上应用广泛。 液质联用分析技术具有灵敏度高，检测浓度达pg/mL，线性范围宽（两段线性范围可达上万倍），选择性高、特异性强（可区分原型药物和代谢产物）等特点； 但存在开发难度大，样品制备耗时长等缺点。 基于核酸杂交的酶联桥接技术检测灵敏度更高，前处理简单。 但需要关键试剂，线性范围窄（20-50倍）、不能区分代谢物。 qPCR法检测灵敏度最高，但和杂交法一样存在无法区分原型药和代谢产物，而且有时检测原药还会受到代谢产物的干扰，还存在特异性和潜在的基质效应影响。 另外，后两种方法需要为每一种待测物设计探针引物，增加了时间和金钱成本，而且化学修饰可能会对结果有影响。

表5 寡核苷酸药物生物分析方法比较[Guy A Tremblay, et al., 2009]

通常，对于小于20 mer的寡核苷酸药物采用LC-MS/MS法灵敏度较高，对于大于20 mer的选择杂交法则灵敏度更有保障，如图15所示。但随着前处理技术和分析技术水平的提高，液质联用法逐渐成为寡核苷酸药物的PK分析的主流方法。从1998年至今，FDA和EMA批准的16个寡核苷酸药物中，如图16所示，有7个采用液质联用法、4个采用基于核酸杂交的酶联桥接法、3个采用HPLC法，2个未披露方法；其中，2019年-2022年获批的7个寡核苷酸药物均采用液质联用法；自2018年开始，生物分析白皮书中就对液质联用法用于寡核苷酸药物的生物分析进行建议和指导。2020年白皮书指出：与基于核酸杂交的酶联桥接法相比，液质联用法能够同时定量原型药及其主要代谢产物，检测动态范围宽，需要较少的试剂。下文主要对液质联用法和基于核酸杂交的酶联桥接技术进行阐述。

图15 液质联用法和杂交法比较(左）和图16 全球获批上市寡核苷酸药物PK分析方法汇总（右）

1、液质联用分析技术

液质联用法，不依赖于引物探针以及特殊试剂，降低前期的试剂耗材成本和时间的投入，特异性强，具有同时定量原型药物和代谢产物的特点。 面临的挑战如： 采用离子对试剂会带来信号抑制，高残留、非特异性吸附等问题，需要对色谱、质谱、样品前处理方法等条件进行全面的优化，需要专业的技术团队建立分析方法。

可以应用于寡核苷酸药物的分离分析的色谱方法包括：离子对反相色谱（IP-LC）、HILIC（Hydrophilic interaction chromatography)、离子交换色谱（IEC）。

HILIC法采用极性固定相，采用反相固定相下使用的极性溶剂作为流动相，如水和乙腈，流动相在固定相上形成水层，主要通过弱的静电相互作用实现分离，如图17所示。采用乙酸铵或者水和乙腈常用于分离寡核苷酸药物。灵敏度不如离子对色谱法，并且其色谱分离有待提高。但相比于IP-LC法也有独特的优势，离子对试剂会干扰或者加和至未知代谢产物，使得未知代谢产物的结构鉴定较为复杂，而HILIC不用离子对试剂，所以对于未知代谢产物的鉴定研究具有显著优势。此外，HILIC法不会产生离子对试剂带来的对仪器的离子抑制作用，对仪器设备较为友好。

离子交换色谱采用带正电的阴离子交换填料作为固定相，保留机制是基于药物和固定相之间的静电相互作用，随着流动相中阴离子浓度的增加，与药物相互竞争固定相从而实现分离，如图17所示。典型的流动相是氯化钠，高氯酸钠加入至Tris或者磷酸盐缓冲液中。优点是可以使药物实现非常好的分离，最大的问题是与质谱不兼容。

目前，寡核苷酸的色谱法以离子对反相色谱（IP-LC）应用最为广泛。离子对反相色谱是利用带正电荷的有机碱与寡核苷酸药物形成呈电中性的离子对，从而被反相色谱柱所保留的原理，如图17所示。由于寡核苷酸药物具有较高的亲水骨架和负电性，决定了它需要有离子对试剂的帮助才可以在色谱柱上有所保留。离子对试剂是两亲性分子，结构中的一端带电或者具有离子化基团，另一端具有“疏水尾巴”。尽管结构中带电部分存在静电相互作用，但是当它们形成离子对后即可有效地封闭待测物的带电性。待测物表现为电中性，可以实现在反相色谱柱上的保留，从而实现分离分析。保留机制较为复杂，包括静电相互作用和疏水相互作用。药物的洗脱取决于离子对试剂烷基链的长度与疏水固定相的相互作用。此外，药物带的电荷数和二级结构也有影响。

图17 固定相与寡核苷酸药物相互作用示意图[Studzińska S, 2018]

a）离子交换色谱，b）离子对反相色谱，c）HILIC色谱

离子对试剂的种类和浓度均影响价态分布及色谱的保留行为。对于寡核苷酸药物带电部分可以和阳离子胺形成离子对，供选择的几种烷基铵盐包括：Triethylamie (TEA)、Hexylamine (HA)、triethylammonium bicarbonate, hexylammonium acetate, N, N-dimethylhexylamine (DMHA)、Diisopropylamine (DIPA)、N-methyldibutylamine (MDBA)、Tributylamine (TBA)、N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)等，如表6所示。常用的酸性调节剂/离子增强剂如Hexafluoroisopropanol (HFIP)、Pentafluoropropanol (PFP)、Trifluoroethanol (TFE)等，如表7所示。

表6 几种常用离子对试剂的基本信息[Gong L, et al., 2014]

表7 几种常见对酸性调节剂的基本信息[Basiri B, et al., 2016]

离子对的形成使得疏水性增加，流动相的有机相含量增加，可以提高信号响应。比如，水相和有机甲醇相中加入TEA和HFIP，使得TEA疏水性增强，溶解性变差，从而使药物在较低浓度TEA存在的情况下具有较好的分离效果；同时，可降低对ESI源的离子抑制效应。此外，离子对试剂的浓度增加，药物的分离效果越好，但是，离子对试剂的使用会产生离子抑制作用，尤其对正离子模式。所以，合适的离子对试剂的浓度，以及合适HFIP的比例，获得好的峰型、响应、分离度。不同的核酸类型，优选的离子对试剂和酸性调节剂也会有所差别。离子对试剂的种类、浓度，以及酸性调节剂的比例对于价态分布、保留行为、峰型、响应、分离度均有影响，均需优化和调节，如图18所示。并且，在母离子和子离子扫描时，需使用离子对试剂，以免难以找到药物的母离子和子离子。

图18 离子对试剂和酸性调节剂的选择和条件优化[McGinnis A C, et al., 2013]

非特异性吸附问题是寡核苷酸药物分析中遇到的主要问题之一。盛装样品的容器、仪器的管路等可以接触药物的地方均可以与药物发生非特异性吸附作用。含磷酸基团的寡核苷酸药物易与金属离子通过疏水作用力或者离子交换力发生非特异性吸附，从而导致LCMS分析时，待测物灵敏度下降，甚至低浓度的峰可能会消失；峰拖尾、峰型变差；高浓度的样品易产生残留，残留通常是由整个流路系统吸附引起的，如自动进样器、管路、色谱柱等部位；还会导致标准曲线线性变差。与药物接触的容器的甲硅烷化是一种有效的抵抗非特异性吸附的手段。在前处理过程中选择合适的耗材和试剂，例如低吸附的材质的枪头、离心管、冻存管等。随着色谱技术的进步，现已出现具备抗吸附能力的仪器设备，比如Waters Premier抗吸附液相系统，比如Waters Premier抗吸附液相系统、如ACQUITY PREMIER Column 抗吸附的色谱柱。此外，药物类型为RNA 的时候可能会被RNase破坏, 所以需要无 RNase容器、枪头或试剂。

尽管MALDI适用于寡核苷酸的离子化，但是对于寡核苷酸药物的磷酸骨架为多聚负离子的特点，ESI负离子模式表现出了更优的结果。所以，对于寡核苷酸药物的分析常选用ESI源，负离子模式。寡核苷酸药物的磷酸二酯键上都带有1个酸性质子，又由于结构中含有多个核苷酸基团，使得ESI源负离子模式下，呈现一系列多种去质子化的分子离子峰[M-nH]n-，表现为多价态分布的特点，如图19所示。多价态分布影响信号响应，有报道，通过降低带电性使其向低质量轴移动，可以增加信号响应。另外，阳离子如金属离子易与多聚阴离子骨架加合，分散离子响应从而会降低质谱响应信号。同时，随着寡核苷酸药物分子量的增加，会严重损失质谱响应。此外，多价态分布和离子加和多特点使图谱变得复杂，不特征、不利于解析。离子对试剂会改善金属加和，并且，在样品制备过程中加入螯合剂，如EDTA，可改善离子加合，有助于寻找母离子。并且，EDTA-阳离子复合物不会被色谱保留，很容易被洗脱，不会影响质谱效率。

图19 Trabedersen的母离子扫描（m/z 350–1000）多价态分布特点[Ewles M, et al., 2014]

对于寡核苷酸药物ESI源检测时，质谱要求待测物需呈现离子状态，流动相具有较低的粘度、低的表面张力、高的挥发性、低的离子强度，同时，对于负离子模式下，pH值高利于离子化；而色谱部分则要求具有较低的pH值和较高的表面张力。在达到好的质谱离子化效率和色谱保留条件之间需要寻求平衡。可采用柱后添加法调节pH值以兼顾离子化效率和色谱保留。由于甲醇具有较低的介电常数，常被用作有机相。此外，需要注意避免流动相挥发导致pH值变化引起的峰位的改变。

由于提取方法的复杂性，需要内标控制提取和检测过程中存在的变异，首选稳定同位素内标，如34S标记PS骨架。但由于同位素内标不易获得，通常会选择结构类似物作为内标，一般内标的分子量可大于待测物的分子量，内标的浓度接近标曲上限为宜，因为高浓度的内标可以占据非特异性吸附位点，降低待测物由于吸附作用带来的损失。

温度也是液质联用法中一个重要的参数，提高色谱柱的温度可以增强动力学和传导特性，提高色谱的分离，同时可以降低流动相的粘度和表面张力以利于质谱信号响应。在采用HFIP/TEA离子对体系分析siRNA时，温度尤为重要。采用高于Tm（melting temperature）值，如45 oC～65 oC，完整的siRNAs会变为正义链和反义链。所以，在样品制备和色谱分离时，都应控制温度低于Tm: 10 oC。

基于核酸杂交的酶联桥接技术

基于核酸杂交的酶联桥接技术（下文简称杂交法）原理是利用碱基互补配对的原则设计可以与药物互补配对的探针，与药物结合形成双链，从而可特异地检测待测物。 杂交实验是采用96孔板，类似于ELISA，但两者实验原理不同。 杂交法为采用待测寡核苷酸的互补链作为捕获探针(immobilization）用于捕获待测物，与待测物相连形成核酸杂交复合物； 检测探针类似于检测抗体（可以标记地高辛），与上述核酸杂交复合物相连，建立桥接体系； 通过与抗地高辛抗体相结合，从而实现检测。 基于杂交的检测法具有灵敏度高、通量高的特点。 同时，杂交实验可以省去生物样品的前处理的环节。 但主要问题是会面临代谢产物的干扰，会使检测结果存在偏差。

杂交实验包括一步杂交法( one-step hybridization/nuclease-based hybridization)、两步杂交法( two-step hybridization)、三明治杂交法(a sandwich hybridization)、双连接杂交法( dual ligation hybridization assay)和竞争杂交法(competitive hybridization)，如图20和图21所示。一步杂交/基于核酸酶的杂交法是互补探针一端标记生物素，另一端标记检测标签，与待测物互补杂交。复合物固定于预包被的链霉亲和素微孔板上，与S1核酸酶共孵育，去除未杂交成双链的单链，选择性地定量原型药物。其中，S1核酸酶的作用不仅仅可以提高实验的选择性，还可以改善标准曲线的线性。一步杂交法无法区分完整的药物和3’端发生代谢的代谢产物，该法会高估原型药物的含量。

图20 基于核酸杂交的酶联桥接技术原理图(A) 一步杂交法，(B)两步杂交法，(C)双连接杂交法.[Kotapati S, et al., 2021]

图21 三明治杂交法的原理[Guy A Tremblay, et al., 2009]

两步法的捕获探针3’端标记生物素，5’端具有延长区域（overhang），待测物-捕获探针复合物被固定于预包被的链霉亲和素包被的微孔板上，具有检测标签的连接探针通过T4连接酶与捕获探针的5’端的延长区域互补结合，未结合的探针被洗去，从而实现待测物的检测。有学者将方法改进避免3’端代谢产物的干扰，但是仍然不能排除5’端代谢产物干扰。但实际上，有报道称寡核苷酸药物在血浆中的代谢产物大多数为3’→5´核酸外切酶作用下生成的3’端代谢产物。

三明治杂交法首先是将与待测物3’端互补结合的捕获探针包被在板子上，与待测物5’端互补的检测探针和待测物杂交结合，这个中间体复合物与固定在板子上的捕获探针结合形成检测捕获探针-待测物-检测探针复合物。该法会同时检测3’端和5’端的N-1和N-2的代谢物。

双连接杂交法可以准确、特异地定量原型药物，不受3’端和5’端代谢产物的干扰。互补模板探针的5’端和3’端的延长区域分别与待测物和标记生物素的捕获探针杂交。复合物固定在微孔板上后，通过酶与检测探针连接形成完整复合物实现检测。该法配合电化学发光ECL检测，会达到非常高的灵敏度和较宽的线性范围。但是，对于短链探针优化得到合适的Tm值较为困难。

竞争杂交法是基于样品中待测物和与待测物具有相同序列的带有检测标签的探针竞争结合至捕获模板的检测原理。竞争法可以作为三明治法和连接法均不适用的第三种选择。比如，当寡核苷酸药物为12-mer时，检测探针和捕获探针太短没法实现特异地杂交，还有3’端不适用或者太短的情况下，均只能通过竞争法实现检测。

杂交温度、捕获和检测探针浓度和去污剂四个主要参数会影响方法的灵敏度和准确度。杂交温度应设置低于Tm值。捕获探针和检测探针通常需要优化系列浓度，以选择最佳反应浓度。去污剂可以降低待测物和血浆蛋白之间的非特异吸附作用，这种非特异吸附作用会导致线性差。检测探针的设计可以依据2个原则，内源性物质不可与捕获探针的5’端的延长区域序列匹配，可以通过BLAST数据库查询；检测探针和捕获探针中应尽可能少地发生碱基配对，以免影响方法的特异性。

此外，血样中抗凝剂的选择也是非常重要的问题，肝素会带来分析上的干扰，可能由于肝素也为负电性，分子量与寡核苷酸药物相近，水溶性强等，所以应选择低分子量的抗凝剂如EDTA为宜。

▌实例一

阳光德美借助其大小分子PK/PD研究综合性平台的优势，攻克重重困难，成功推动了国内首个自主创新寡核苷酸药物的药代动力学研究，建立了可以同时检测临床血、尿、粪样品中原型药及其代谢产物的生物分析方法，并成功将方法应用于寡核苷酸药物临床药代动力学研究，为II期研究采血点的调整、剂量的调整提供了科学依据。

图22 典型质谱图和首次（右上）和末次（右下）给药人血浆中原型药及其代谢产物的C-t图（Mean±SD, n=6）

▌实例二

Patisiran是2018年获得FDA批准的siRNA脂质体药物，对于特殊制剂，需要有特殊的考量，该研究不仅检测了原型药物，还检测了2种新型脂质体部分。 下图是获得的药时曲线，结果表明： 该siRNA药物的血浆-药时曲线呈现双相消除的特点，开始呈现迅速降低现象，可能是因为药物快速从循环进入组织，浓度再次升高可能是由于药物从肝脏再分布至血中所致。 在给药剂量范围内暴露随剂量呈比例增加。 另外，研究者还选取了一个剂量组检测了未结合的siRNA药物，结果表明，未结合的siRNA药物占总siRNA的量不到0.1%，研究者认为该脂质体在循环中的比较稳定。

对于如脂质体、胶束等复杂制剂的生物分析需要一些特殊的对策，才能全面回答药物的PK问题，阳光德美具有丰富积累和经验。

图24 健康受试者中药物血浆C-t曲线 patisiran siRNA (A), DLin- MC3-DMA (B) and PEG2000-C-DMG (C).

结语

近年来，随着基因治疗药物的不断发展，为肿瘤及罕见病患者带来了新的用药选择。寡核苷酸药物的研究已有30余年，目前有15种寡核苷酸药物获批上市，但关于寡核苷酸药物结构的修饰、药代特性的优化、递送系统的改进、疗效的加强、副作用的降低等问题，仍需不断探究。同时，上述问题的攻克也对寡核苷酸药物的生物分析领域提出了更高的要求和挑战，期待多样化的平台技术相互支撑，质谱、免疫、分子生物学等多学科相互交融，共同推动寡核苷酸药物的研发进入新的发展时期。

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