一、PCR概述

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，模板通常只需要纳克(ng)水平，甚至是皮克(pg)水平，通过25-35轮反应，就可将目的片段扩增。反应最终的 DNA扩增量可用Y＝(1＋X)^n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示Y平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

PCR是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为95℃-98℃，取决于酶的耐热特性）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq 酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；

(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；

(3) 从cDNA中克隆某些基因；

(4) 生成大量DNA以进行序列测定；

(5) 突变的分析；

(6) 染色体步移；

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

二、试剂准备

1. DNA模板

2. 对应目的基因的特异引物（也可能是随机序列组成的6mer脱氧核糖核酸混合物或Oligo(dT)，可用于反转录）

3. 10×PCR Buffer （一般是10×，其实就是反应总体积÷(Buffer上写明的×数)=要加的Buffer量

4. 2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM（一般Buffer含有，可不用额外加，看说明书）

5. DNA聚合酶（同样一般Buffer含有）

三、操作步骤

1. 在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌PCR管中(20uL体系)：

10×PCR buffer        2  uL；

引物1（5～20umol/L） 0.5 uL；

引物2（5～20umol/L） 0.5 uL；

DNA模板（50ng～5ug）  1  uL；

加ddH2O至20uL；

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在95℃预变性3-5min，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。进入循环扩增阶段：95℃ 30s → 58℃ 30s (取决于引物) → 72℃ 60s(取决于目的片段大小和酶扩增速度)，循环 25-35 次，最后在72℃保温10min。

3. 结束反应，PCR 产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4. PCR产物的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100uL氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10uL电泳检测。

四、常见问题

1. 假阴性

不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用；④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，去查OD值；可能蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；②在提取制备模板时丢失过多；浓度过低或过高都可能无条带；③模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

2.阴性

需注意的是有时忘加聚合酶酶或核酸染料。

引物：引物质量、GC含量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是否出现引物二聚体。

3.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不好：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

退火温度过低，可适当调高退活温度可增加特异性，可用软件(如SnapGene)预测引物的退火温度。

酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度。

出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，退火温度过低，循环次数过多引起。可以减少酶量，或调换另一来源的酶；增加模板量，减少循环次数。

五、注意事项

1. PCR 反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。（最好设立一个专用的PCR空间，有些实验室空气污染导致一直有非特异条带出现。）

2. 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

3. 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

4. PCR试剂配制应使用新鲜双蒸水，高压灭菌。

5. 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

6. 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

7. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。