图2 PCR的基本原理

图3 PCR的流程步骤

那在扩增完成之后我们需要对扩增出来的DNA进行检测，常规的PCR技术通常只能借助凝胶电泳手段，其是根据DNA的分子量大小不同对DNA进行分离，从而进行鉴定以及纯化DNA的技术。

2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

实时荧光定量PCR，即Real-Time PCR，即第二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR反应过程中通过收集荧光信号来实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过CT值和标准曲线对待测检测样品进行定量分析。qPCR在聚合酶链反应“变性一退火一延伸”扩增过程的“延伸”段，对荧光探针标记的靶基因荧光信号进行实时采集，通过3个参数(荧光信号-Ct值-靶基因的起始浓度)间的关系，最终确定靶基因的拷贝数或基因的表达水平。

实时荧光定量PCR 极大地扩展了PCR 技术在整个生命科学的研究与应用，例如，感染性疾病、肿瘤遗传性疾病、移植配型、个性化用药等众多医学领域。尤其是在临床医学检验和食品安全检测等领域迅速发展，成为许多病原微生物诊断的金标准。但由于定量 PCR 的绝对定量分析结果最终依赖于 Ct 值和标准曲线，这是其最大的技术瓶颈，所以在某种意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶基因分子模板浓度差异细微的条件下其检测灵敏度、精确度和分辨率都受到了限制。

qPCR常用的荧光主要有两种：TaqMan探针法和SYBR Green法。

①荧光探针法（TaqMan技术）：

TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。Taqman探针是最为常用的一种水解探针，在探针的5’端存在一个荧光基团，通常为FAM，探针本身则为一段与目的基因互补的序列，在探针的3’端有一个荧光猝灭基团，根据荧光共振能量转移原理(Förster resonance energy transfer， FRET)，当报告荧光基团（供体荧光分子）和猝灭荧光基团（受体荧光分子）激发光谱重叠且距离很近时（7-10nm），供体分子的激发可以诱发受体分子发荧光，而自身荧光减弱。所以PCR反应开始，探针游离于体系中完整存在时，报告荧光基团并不会发出荧光，当退火时，引物和探针结合于模板，在延伸阶段，聚合酶不断的合成新链，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到达探针时，DNA聚合酶就会将探针从模板上水解下来，报告荧光基团和猝灭荧光基团分开，释放荧光信号。由于探针和模板存在一对一的关系，所以在试验的精度和灵敏度上，探针法都要优于染料法。每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。

优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。

缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。

②荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能够与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。

缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。

图4 荧光探针法和荧光染料法的工作原理

注：多重PCR，也称多重引物PCR或复合PCR，是在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的一种新型PCR扩增技术。

3.数字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

数字PCR即第三代PCR，即绝对定量PCR。与传统技术不同，基于泊松分布原理，数字 PCR 技术将 DNA 或RNA 样品分散成大量的微反应单元（纳升级）中，然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板 PCR 扩增、荧光检测和统计学分析，实现绝对定量，不依赖于标准曲线和已知浓度的多个梯度标准品，直接检测样品中核酸的原始浓度。由于这种检测方式具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性，数字 PCR 迅速得到广泛的关注，尤其在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测、核酸拷贝数变异和基因表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。

图5 数字PCR的基本原理

4.逆转录PCR（Reverse T ranion-PCR,RT-PCR）

逆转录PCR或者称反转录PCR（reverse tranion-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。

5.实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse tranion（逆转录）的意思，所以RT-qPCR是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。

图6 RT-qPCR的一步法和两步法

三、PCR实验常见问题及对策

问题1：阳性对照有条带，而样本无结果

原因：①模板含有抑制物，含量低；②Buffer 对样品不合适；③引物设计不当或者发生降解；④反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。

对策：①纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量；②更换 Buffer 或调整浓度；③重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者更换一管新引物；④降低退火温度、延长延伸时间。

问题2：非特异性扩增

原因：①引物特异性差；②模板或引物浓度过高；③酶量过多；④Mg2+浓度偏高。

对策：①重新设计引物或者使用巢式 PCR；②适当降低模板或引物浓度；③适当减少酶量；④降低 Mg2+浓度，或更换 mix。

问题3：GC-rich（正常范围为40-60%，>60%为GC-rich）区域难以扩增

原因：GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链，常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上，DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止，结果出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。

对策：①提高预变性温度或变性时间，使双链完全打开；②TD-PCR（梯度 PCR ）；③换用热启动酶或 mix；④增加 DMSO 等共溶剂，协助 DNA 变性，降低引物 Tm 值，提高产物扩增特异性。

问题4：产物在凝胶上呈 Smear 状态

原因：①模板不纯；②Buffer不合适；③退火温度偏低；④酶量过多；⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。

对策：①纯化模板；②更换 Buffer 或 mix；③适当提高退火温度；④按浓度比例设置酶的添加量；⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度；⑥减少反应循环次数。

问题5：空白对照出现目的扩增产物

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染。

对策：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用；③各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

四、结语

PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，但是它们之间存在一些区别。

1.PCR：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增DNA分子的技术，利用DNA聚合酶和多个引物在所需温度下扩增目标DNA分子。PCR反应分为三个阶段：预变性、变性-退火-延伸和延伸。PCR技术主要用于DNA序列的扩增和检测，应用广泛，如基因克隆、DNA序列测定等。

2.qPCR：实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种实时检测PCR过程中荧光信号变化的技术，可以定量检测目标分子的含量。qPCR通过在反应体系中加入荧光探针或荧光染料，在PCR过程中实时监测荧光信号的变化，从而计算出目标分子的拷贝数。qPCR技术主要用于DNA或cDNA的定量分析，如基因表达分析、病毒载量检测等。

3.RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种把RNA分子转录为cDNA后，在体外进行DNA扩增的技术。RT-PCR技术结合了反转录和PCR两个步骤，主要用于RNA分子的扩增和检测，如基因转录水平分析、miRNA表达研究等。

4.RT-qPCR：逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是一种结合了逆转录PCR和实时定量PCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA，然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究，如基因表达分析、病毒载量检测等。

总之，PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术的主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的扩增和检测；而RT-qPCR则结合了RT-PCR和qPCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。

表1 不同PCR方法的主要优缺点

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