【原理】

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍运用于分离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳(disc-electrophoresis)和平板电泳(slab-electrophoresis)。不论圆盘电泳或平板电泳都有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的体系中进行，称为连续PAGE；电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液pH不同、凝胶孔径不同的体系中进行，称为不连续PAGE。不连续PAGE分离中包括三种物理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续PAGE则不具备浓缩效应。本实验介绍不连续聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。

【试剂及器材】

1．分离胶缓冲液(pH8.9) 称取Tris 36.3g，lmol／L HCl溶液48ml，加蒸馏水80ml使其溶解，pH调至8.9，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．浓缩胶缓冲液(pH6.7) 称取Tris 5.98g，lmol／LHCl溶液48ml，加蒸馏水至80ml使其溶解，pH调至6.7，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。

3．凝胶贮备液(30％单体交联剂) 称取丙烯酰胺(Acr)29.2g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水溶解后定容至100ml，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中， 4℃冰箱保存，可使用1个月。

4．电极缓冲液(pH8.3) 称取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g，加蒸馏水至850ml，调pH至&3，用蒸馏水定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时可作10倍稀释。

5．催化剂(10％过硫酸铵) 称取过硫酸铵0.5g，加蒸馏水5ml。临用前配制，4℃冰箱存放，最长不超过1周。

6．加速剂(四甲基乙二胺，TEMED) 原包装液，存于4℃冰箱备用。

7．染色液 称取考马斯亮蓝R—250(CBBR—250)L 25g，加入50％甲醇454ml溶解，再加入冰醋酸46ml，混匀。

8．固定液 12.5％三氯醋酸(TCA)

9．洗脱液 取冰醋酸30ml，甲醇125ml，用蒸馏水定容至500ml。

10．保存液 7％冰醋酸。

11．0.05％溴酚蓝

12．电泳仪 选用电子管或晶体管整流电源。电压0—600V，电流0—300mA。

13．电泳槽 圆柱型垂直电泳槽。

14．凝胶玻管 0.5～0.6cm×10cm。

15．小烧杯，50ul微量进样器，10cm长针头或腰椎穿刺针头，5或10ml注射器。

(1) 取已准备好的0.6cm×10cm玻管，从一端量至7cm和7.5cm两处，用玻璃蜡笔划线，插入橡皮垫后垂直置于小试管中。

(2) 配制分离胶：取一小烧杯，按表4-1加入各液，摇匀，此液总体积为10ml，凝胶浓度为7.5％。用5ml注射器、长针头或用毛细滴管吸取分离胶液，沿管壁注入玻管至7cm划线处，小心在凝胶液面上覆盖一层蒸馏水(约0.5cm高)，尽量避免冲击凝胶液面。待凝胶与水交界面可见一分界线后，倾去覆盖的水并用滤纸条吸干。

(3) 配制浓缩胶：按表4加入各液，摇匀。总体积为10ml，凝胶浓度为3.0％。按上法沿壁注入凝胶管至7.5cm处，再沿管壁加入蒸馏水(约0.5cm高)。待聚合后倾去并吸干蒸馏水，准备加样。

2．加样 取血清0.1ml，40％蔗糖液0.1ml及0.05％溴酚蓝0.1ml(作示踪染料)于一小试管中混匀，用微量加样器吸取10tq加到玻管浓缩胶表面，相当于加血清3.3ul。

(1)将已加样的凝胶管安装在电泳槽上的橡皮孔中，使凝胶顶部恰好可见，并弃掉下端的橡皮垫。

(2)用毛细滴管吸电极缓冲液，小心注满凝胶玻管(不能搅动样品层)。然后将电极缓冲液慢慢倒人上、下电极槽中，上槽应浸没凝胶玻璃管，下槽液面应超过凝胶玻管下端。小心排除凝胶管的上、下管口内可能存在的气泡，否则会影响导电。

(3)将上槽的电极接电泳仪的负极，下端接正极，通电。先调节电流为1毫安／管，待示踪染料进入分离胶后，再调节电流为2毫安／管。待示踪染料达到玻管下口约0.5cm时，切断电源，电泳完毕。

4．剥胶 取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸满蒸馏水。将针头小心插入胶柱与管壁之间，一边注水一边旋转玻管，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出。

5．固定、染色 将凝胶柱浸泡于12.5％的TCA中0.5～1h，然后转入CBBR-250染色液中染色l～2h，或90℃水浴中染色10min。

6．脱色、保存 将已染色的凝胶柱置于7％冰醋酸溶液中浸洗，不断更新冰醋酸，直到浸洗无色为止。全过程约需5—7d。或用洗脱液漂洗3～4次，每次20—30min。取lcm×l5cm小试管，内盛7％冰醋酸溶液，把凝胶柱浸泡其中，加塞蜡封即可长期保存。

(1)切片抽提法：切割特定区域的片段，用10倍量的水或0.1-0.2mol／L NaCl或适量的缓冲液进行匀浆。4℃过夜抽提，离心取上清液，选择合适的波长测定吸光度值。这种定量方法准确性不高，可作为样品的回收方法。

(2)微量光密度计法：目前已有不经染色直接进行紫外扫描的微量光密度计，也有必需经过染色后进行测定的光密度计，还有配备显微装置的超微量光密度计。为了消除圆柱状凝胶的球面差，可将胶条放人7％冰醋酸内进行测定。

1．Acr和Bis是神经毒剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，操作时要注意保护。

2．Acr和Bis在低温下稳定，应放棕色瓶干燥低温(4℃)保存。30％单体交联剂应装棕色瓶中，贮存于冰箱(4℃)能部分地防止水解，但也只能保存l～2月。可测定pH(4.9～5.2)来检查是否失效，失效液不能聚合。

3．在制胶过程中用蒸馏水封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

4．TEMED宜密封避光保存。

5．制备凝胶用玻管要用洗液浸泡清洁，如玻管不清洁，倒胶后在管壁会出现气泡。

6．制备分离胶和浓缩胶时，加入催化剂和加速剂混合后约在10～30min内聚合，故应尽快注人玻管。如室温过高，为防止过快聚合，可置冰浴中操作。如果凝胶不聚合，通常是由于制备的试剂浓度不准确，或者凝胶混合液中漏加某一试剂，也可能是试剂不纯所致。应重新配制混合液。

7．本法可简化，用同一分离胶以及同一缓冲液和pH的连续凝胶电泳，也可获得较好的结果。