✎  前 言  

自从纳米抗体(VHH)于1993年发现以来，已经在多个领域展现出巨大的应用潜力，尤其是纳米抗体因其优良的特性在疾病诊疗方面具有显著的优势。骆驼科动物中纳米抗体因其独特的优势备受关注，而骆驼科动物中的常规抗体IgG1约占Total IgG的50%，且重链人源化程度最高可以达到94%，轻链最高可以达到91%，同样也具有成为治疗性抗体的潜力(图1)。关于骆驼科动物中的常规抗体IgG1的相关介绍可以参见《骆驼科动物IgG1抗体的另一面》一文。针对骆驼科动物常规抗体IgG1，阿帕克生物目前已经成功搭建羊驼单链抗体(Single-chain Antibody，ScFv)噬菌体展示技术平台(图2)，对羊驼常规抗体IgG1进行开发。本期公众号我们将对该技术平台进行简要的介绍。

图1. 骆驼科物种抗体亚型（doi: 10.3389/fgene.2019.00997）

图2. 羊驼IgG1抗体发现流程

羊驼免疫 

选择1-1.5岁身体健康未经免疫的羊驼进行免疫

免疫原包括：重组抗原蛋白，过表达抗原细胞

免疫次数：4次免疫，间隔21天

PBMC分离：采集第三次和第四次免疫后50ml外周血分离PBMC免疫后，可以同时开展羊驼纳米抗体(VHH)和传统IgG1抗体(ScFv Format)开发

羊驼ScFv噬菌体展示文库构建 

Total RNA 提取

采用Trizol法提取Total RNA，并使用1%琼脂糖凝胶鉴定RNA，应保证RNA条带清晰无明显降解(图3)，同时用NANODROP ONE 进行浓度测定。将鉴定正确的Total RNA反转录为cDNA备用。

图3. RNA电泳图 M：Maker；1：Total RNA

巢式PCR扩增              

使用巢式PCR(Nested PCR)扩增方法，通过两轮(图4-9)扩增获得特异性较高的羊驼重链(VH)和轻链(Vλ、VK)。

      图4                                  图5                                图6 

图4. VH第一轮扩增结果，扩增片段大小500bp，M：Maker；1-5：VH片段。

图5. Vλ第一轮扩增结果，扩增片段大小500bp，M：Maker；1-5：Vλ片段。

图6. VK第一轮扩增结果，扩增片段大小500bp，M：Maker；1-5：VK片段。

   图7                                  图8                              图9 

图7. VH第二轮扩增结果，扩增片段大小480bp，M：Maker；1-5：VH片段。

图8. Vλ第二轮扩增结果，扩增片段大小480bp，M：Maker；1-5：Vλ片段。

图9. VK第二轮扩增结果，扩增片段大小480bp，M：Maker；1-4：VK片段。

Overlap-PCR使用Overlap-PCR的方法，将上述获得的重链(VH)分别与轻链（Vλ和VΚ）进行Overlap-PCR连接(图10和图11)，从而获得羊驼单链抗体ScFv基因片段。

                              图10                                图11                    

图10. VH+Vλ Overlap-PCR结果，扩增片段大小750bp，M：Maker；1-5：VH+Vλ片段。

图11. VH+VΚ Overlap-PCR结果，扩增片段大小750bp，M：Maker；1-5：VH+VΚ片段。

电转化和噬菌体文库展示

将羊驼ScFv基因片段与噬菌体展示载体连接后，电击转化入E.coli SS320中，构建羊驼ScFv噬菌体展示细菌文库，取电转后文库100μL，稀释至10-3和10-4，进行文库转化子测定，转化子数目达到109(图12)。收集羊驼ScFv噬菌体展示细菌文库，将其进展噬菌体文库展示，包装成羊驼ScFv噬菌体展示文库，用于后续筛选。

图12. 羊驼 ScFv细菌文库转化子数鉴定

羊驼ScFv文库插入率鉴定 

随机从测定羊驼ScFv噬菌体展示细菌库文库转化子数测定滴度平板上挑取48个克隆进行菌液PCR鉴定文库插入率，由图13可知，目的片段大小为750bp，文库插入率可达100%。

图13. 羊驼 ScFv细菌文库插入率鉴定

羊驼ScFv文库多样性分析

将文库插入率鉴定获得的阳性克隆进行测序，对测序成功后结果进行分析，由图14和图15可知，文库多样性良好。

图14. 羊驼 ScFv细菌文库多样性测序VH和VL CDR3氨基酸序列

图15. 羊驼 ScFv细菌文库多样性氨基酸序列进化树

羊驼ScFv噬菌体展示文库筛选 

采用固相筛选，对构建的羊驼ScFv噬菌体展示文库进行筛选，经过两轮筛选，在第二轮检测筛选洗脱物滴度平板上随机挑取45个克隆进行噬菌体上清单克隆ELISA鉴定(表1)，鉴定结果发现阳性率达85%(OD450>1.0)。同时将阳性克隆测序，测序成功后对序列结果进行分析，发现筛选获得的序列多样性良好。

表1 羊驼ScFv噬菌体展示文库筛选噬菌体上清单克隆ELISA鉴定

图16. 羊驼ScFv噬菌体展示文库筛选阳性单克隆ScFv VH和VL CDR3氨酸序列

图17. 羊驼ScFv噬菌体展示文库筛选阳性单克隆ScFv氨基酸序列进化树

羊驼IgG1抗体表达纯化后蛋白细胞结合活性检测及人源化程度分析 

将筛选获得的Ag ScFv-7和Ag ScFv-14还原为IgG，融合human IgG1 FC进行表达，纯化后进行细胞活性流式鉴定(图18)，结果发现两个克隆均能与表达靶抗原的细胞系结合。同时对Ag ScFv-7重链(VH)和轻链(VL)人源化程度进行分析，发现羊驼IgG1重链人源化程度为86.3%，羊驼IgG1轻链人源化程度为84%，人源化程度已经较高，后续继续进行人源化改造容易。

图18. 羊驼IgG1抗体蛋白细胞结合活性流式检测

✎  总 结   羊驼常规抗体IgG1与人的抗体同源性非常高，达到了80%以上，在抗体药物开发时人源化相对简单。目前，基于骆驼科常规抗体IgG1进行抗体药物开发的公司只有arGEN-X，其以Simple Antibody™抗体药物开发平台开发的抗CD70(ARGX-110)和抗c-MET(ARGX-111)已经在进行临床试验。抗体药企业在考虑采用纳米抗体进行成药时，同时也可以考虑骆驼科常规抗体IgG1进行成药，只需一次免疫羊驼，就可以同时获得两种抗体，为后期成药提供更大的保障。阿帕克生物目前针对羊驼常规抗体IgG1，成功开发出羊驼ScFv噬菌体展示技术平台，可以为广大抗体药企‍提供羊驼常规抗体IgG1发现服务。