7. Luria-Bertani（LB）培养基（Sigma-Aldrich L3152）和琼脂（OXOID，目录号：LP0013）；LB固体培养基，琼脂添加量为1.2%（w/v）

8. 氨苄青霉素（工作浓度100mg/L）（Sigma-Aldrich，目录号：A0166-5G）

9. 限制酶：

PacI（New England Biolabs，目录号：R0547S）

MluI（New England Biolabs，目录号：R0198S）

SpeI（New England Biolabs，目录号：R0133S）

10. 乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）

11. 醋酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）

12. mMessage mMachine T7体外转录试剂盒（Ambion Sigma-Aldrich，目录号：AM1344）

13. John Innes 2号肥料（韦斯特兰园艺）

14. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：410225）

15. K2HPO4（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）

16. 焦磷酸钠十水合物（Sigma-Aldrich，目录号：221368）

17. 膨润土（Aldrich，目录号：28,523-4）

18. 硅藻土（Fluka，目录号：22141）

19. 5×GP缓冲液（见配方）

20. FES缓冲液（见配方）

设备

1. 植物生长室（24°C，16h/8h光周期和55%湿度）

2. 无菌培养管（Falcon，目录号：352057）

3. 离心管（SARSTEDT AG，目录号：72.695.500）

4. 滤纸（Whatman，目录号：1001-090）

5. 冷冻离心机（Eppendorf）

6. 震荡培养箱（New Brunswick Scientific）

7. 凝胶回收试剂盒（Helixx Mupid-exU）和图像系统（Fusion Fx vilber lourmat）

8. 热循环仪（MJ Research PTC200）

9. 凝胶电泳仪（Helixx Mupid-exU）

10. 高压釜（Priorclave）

软件

Primer3软件（0.4.0版；http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）

步骤

1. 种子萌发和植株生长

（1）将大麦种子置于直径9cm的培养皿中，培养皿中装有2张滤纸（直径90mm）和6mL无菌水；

（2）用铝箔覆盖培养皿，并在4°C黑暗条件下静置2天；

（3）将平板转移到21°C黑暗条件下萌发2天；

（4）将黄化的幼苗以2株/盆的密度移植到装有John Innes 2号肥料的3英寸盆中；

（5）在22°C长日照条件下（16h/8h）种植植株，每隔一天浇水一次，相对湿度保持70%。

2. 病毒诱导的基因沉默

注意： BSMV是一种单链RNA病毒，由α、β和γ RNA三个基因组成。将代表待沉默基因片段的转录序列插入到紧邻DNA质粒编码γ的开放阅读框的终止密码子下游，RNA由DNA质粒中编码α、β和γ的片段合成。当大麦幼苗侵染了这三个RNA片段，则会导致病毒dsRNA的合成，从而激活抗病毒RNA沉默途径，导致目标基因沉默。在本文中，作者使用两种靶向非重叠基因片段的载体展示了大麦 Brassinosteroid-Insensitive-1 （ BRI1 ） 基因的VIGS。

（1）BRI1基因的两个独立片段是从大麦基因组DNA中扩增出来的。首先，使用Primer3软件设计HvBri1A-F/R或HvBri1B-F/R片段的特异性引物（表1）；PCR体系：1µL 10×高保真PCR缓冲液、0.4µL 50mM MgSO4、0.2µL 10mM dNTPs Mix、0.2µL 5µM正向和反向引物、0.05µL 5U/µL Taq DNA聚合酶、30ng基因组DNA以及ddH2O至10µL。反应在Peltier热循环仪中进行，设置PCR程序：94°C预变性2min、94°C变性30s（30个变性循环）、60°C退火30s、68°C延伸45s，72°C延伸5min。

表1 用于BRI1基因VIGS的引物

注意：设计基因沉默的引物时，确保PCR产物不包含用于后续线性化质粒所需酶的限制性位点。

（2）通过pGEM-T Easy克隆试剂盒将扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体上，并通过电击转化到大肠杆菌DH5α中。

（3）采用PacI和SmaI酶酶切携带沉默片段的重组pGEM-T载体，之后，通过凝胶提取纯化目的片段，然后克隆到PacI和SmaI剪切过的γ RNA载体pSL038-1上。

（4）通过电击法将含有 BRI1 基因片段的重组pSL038-1-BRI1A（pγ-BRI1A）和pSL038-1-BRI1B（pγ-BRI1B）质粒转化到大肠杆菌DH5α中，随后用Macrogen Inc.对克隆产物进行测序。使用载体特异性引物pGamma-F/R（表1）检查沉默片段的方向。向具有正确方向的阳性克隆菌液中加入甘油，并在-80°C冰箱中储存。

（5）使用携带质粒pα、pβ、pγ、pγ-PDS、pγ-BRI1A和pγ-BRI1B的大肠杆菌甘油原液在补充有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线，并在37°C下培养过夜。

（6）将来自每个平板的单菌落接种到添加有100mg/L氨苄青霉素的10mL LB液体培养基中，并在37°C下培养过夜。

（7）根据产品说明书，使用QIAGEN QIAprep Centrifuge Miniprep Kit进行质粒提取。

（8）采用MluI酶对质粒pα、pγ、pγ-PDS、pγ-BRI1A和pγ-BRI1B进行线性化，SpeI酶对质粒pβ进行线性化。随后，线性化质粒使用1/2体积的5M醋酸铵和2倍体积的无水乙醇沉淀过夜，然后以18,000x g 离心15min。DNA沉淀用70%乙醇洗涤，风干并重悬于50µL无RNase的水中（对于50个幼苗，每个幼苗1µg线性化质粒）。

（9）根据产品说明书，使用mMessage mMachine T7体外转录试剂盒从线性化质粒pα、pβ、pγ、γ-PDS、pγ-BRI1A和pγ-BRI1B中制备加帽体外转录物； 之后，在1%琼脂糖凝胶上检查制备的加帽转录本。 在大约10,000bp处应有一条暗带，在大约3,000bp 处应有一条亮带。

注 ： 任何较小条带的拖尾都表明RNA转录物的降解。

（10）每株植物均通过将9µL FES缓冲液与0.35µL α、β和相关的基于γ的转录物[γ、γ-PDS（阳性对照）、γ-BRI1A或γ-BRI1B]混合制备VIGS接种物，FES缓冲液用作模拟处理。

（11）在拇指和食指之间将10µL转录物混合物或FES（模拟处理）通过摩擦来接种10天龄幼苗的第一片叶子（小心不要损坏叶子）。

（12）14天后，评估植物基因沉默的表型。在PDS沉默植物的情况下，叶子出现光漂白（图1）， BRI1 沉默植物显示矮化的症状（图2）。

（13）为确认沉默效果，将第三片叶子在液氮中快速冷冻（可在RNA提取之前储存于-70°C冰箱），随后使用制造商提供的TriZol TM 方案从植物中提取总RNA。

（14）使用 BRI1 特异性引物（HvBRi1:RT，表1）和相对于RNA解旋酶管家基因（HvRNAH，表1）的引物，通过RT-PCR定量基因沉默。

注 ：重要的是在克隆到pγ质粒的基因片段之外设计定量引物。

图1 大麦中PDS基因的沉默导致光漂白并导致叶子变白。（A）FES处理（阴性对照）；（B）BSMV:00（实验处理）；（C）BSMV:PDS（阳性对照）。

图2 Hv BRI1的沉默导致大麦植株生长发育迟缓。（A）FES处理（阴性对照）；（B）BSMV:00（实验处理）；（C）BSMV:HvBRI1（阳性对照）。

注意事项

1. 不要将γ-PDS与其他γ样品混合；

2. 每次处理都必须更换手套；

3. 处理叶子时，要轻柔，不要过多损坏叶子。

配方

1. 5×GP缓冲液（500mL）

18.77g甘氨酸

26.13g K 2 HPO 4

用ddH 2 O调至500mL并立即使用

2. FES缓冲液（500mL）

1 00mL GP缓冲液

5g焦磷酸钠十水合物

5g膨润土

5g硅藻土

用ddH 2 O调至500mL

等分成50mL并高压灭菌

（121°C 20min）

等分试样可以在室温无菌条件下储存

References：

Ali, S. S., Gunupuru, L. R., Kumar, G. B., Khan, M., Scofield, S., Nicholson, P. and Doohan, F. M. (2014). Plant disease resistance is augmented in uzu barley lines modified in the brassinosteroid receptor BRI1. BMC Plant Biol 14: 227.

Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C. and Pogue, G. P. (2002). Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant J 30(3): 315-327.

Scofield, S. R. and Brandt, A. S. (2012). Virus-induced gene silencing in hexaploid wheat using Barley stripe mosaic virus vectors. In: Watson, J. M. and Wang, M. B. (eds). Antiviral Resistance in Plants: Methods and protocols. Springer, 93-112.

Scofield, S. R., Huang, L., Brandt, A. S. and Gill, B. S. (2005). Development of a virus-induced gene-silencing system for hexaploid wheat and its use in functional analysis of the Lr21-mediated leaf rust resistance pathway. Plant Physiol 138(4): 2165-2173.

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