5步实现蛋白分离和纯化 |
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从样本中提取并稳定您的靶蛋白
蛋白提取技术因原始材料的来源、感兴趣蛋白在细胞内的位置以及下游应用而异。其他重要的考虑因素包括保持蛋白活性和功能以及降低背景影响。 蛋白提取 组织和细胞裂解过去，人们使用机械破坏裂解细胞和组织；我们开发的温和、去垢剂型解决方案旨在有效地裂解细胞并实现亚细胞结构的分离但无需物理破坏，实现活性蛋白的高产量。 蛋白提取产品的特点： 经过优化—配方较大程度地提高蛋白产量并保持蛋白活性高效—仅亚细胞组分之间出现较少交叉污染兼容—提取物可直接用于大多数下游应用温和—无需对大多数样本类型进行机械细胞破坏 在多种哺乳动物细胞类型和细胞腔室中实现高蛋白产量使用 M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂从主要细胞腔室中提取蛋白的效率。使用 M-PER 试剂从规定细胞系和原代培养物制备裂解物并评估了从多种细胞腔室中提取的效率。对于各靶蛋白，加入 10 μg 裂解物以便通过 SDS PAGE 电泳、转印到硝酸纤维素膜上并使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物进行蛋白质免疫印迹检测。 使用 M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂从各种细胞类型中提取蛋白的产量。在汇合度为 85% 时收集细胞，清洗两次并在冰浴的 PBS 中收集，然后计数。对于每种细胞类型，将 1 x 106细胞通过 2,000 x g 离心 5 分钟进行沉淀，并在 1 mL M-PER 试剂中裂解 5 分钟。通过以 14,000 x g 离心 10 分钟澄清细胞裂解物，收集上清液并使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度（µg/百万细胞） 膜蛋白的高效选择性富集使用 Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒提高蛋白产量。使用 Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒及其他三种商用提取试剂盒从小鼠肝组织和 HeLa 细胞中分离膜蛋白。利用 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量试剂盒对膜、细胞质和总蛋白的产量 (μg) 进行测定。 从各种组织中高效提取蛋白使用 T-PER 组织蛋白提取试剂提取组织细胞裂解蛋白的产量。对重复的组织样品进行称重，以1:10至1:20 w/v T-PER 试剂重新悬浮，并在冷冻的 Dounce 或台式组织均质仪中破碎。在 10,000 x g 下离心所得裂解物5分钟并收集上清液。通过 Pierce BCA 蛋白定量测定每种裂解物的蛋白浓度，从而确定每毫克起始组织的蛋白产量。 从细菌细胞中高效提取蛋白两种细菌细胞裂解试剂的蛋白产量比较。将大肠杆菌 ER2566/pLATE51-Klenow、ER2566/pGST-CC-StpB 和 ER2566/pGS-Syk 细胞沉淀物 (0.5 g) 重悬于 Thermo Scientific B-PER 全套细菌蛋白提取试剂或 EMD Chemicals BugBuster 预混液的 2.5 mL 等分试样中，室温下轻轻涡旋15分钟。在 4°C 下以 16,000 x g 离心20分钟，去除不溶性细胞碎片。使用 Pierce BCA 蛋白测定试剂盒 测定可溶性组分的蛋白产量（浓度）。 样本类型目标产品推荐原代或培养的哺乳动物细胞或组织总蛋白提取M-PER 试剂T-PER 试剂N-PER 试剂RIPA 裂解和提取缓冲液IP 裂解液培养的哺乳动物细胞或组织亚细胞分级或细胞器分离NE-PER 试剂亚细胞组分分离试剂盒线粒体分离试剂盒GPCR 提取和稳定试剂细胞表面蛋白分离试剂盒Syn-PER 试剂溶酶体富集试剂盒细菌细胞总蛋白提取B-PER 试剂 酵母菌细胞总蛋白提取Y-PER 试剂 昆虫细胞（杆状病毒）总蛋白提取I-PER 试剂 植物组织（叶、茎、根、花）总蛋白提取植物总蛋白提取试剂盒 去垢剂溶液去垢剂常用于细胞裂解试剂配方及其他蛋白研究方法。Thermo Scientific Surfact-Amps 去垢剂溶液采用高纯度、预先精确稀释 (10%) 的配方，非常适合用于对未纯化去垢剂中的杂质敏感的应用或测定。 蛋白去垢剂产品特点： 精准——精确溶解于超纯水中的10％去垢剂溶液易用——溶液易于分配和进一步稀释高纯度——过氧化物和碳基含量低于 1.0 μq/mL稳定——在惰性氮气条件下装入玻璃安瓿或 HDPE 瓶中去垢剂分子的一般结构。 蛋白稳定细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致酶活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止这些不利影响，需要向裂解试剂中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。现已发现多种可以破坏或抑制蛋白酶和磷酸酶活性的化合物。 蛋白酶和磷酸酶抑制剂产品特点： 使用便捷——公开的即用型广谱配方，提供浓缩液液、片剂或胶囊的形式，以及多种包装规格，有效期至少为1年全面保护——蛋白酶和磷酸酶抑制剂二合一配方，以液体和片剂的形式提供（含 EDTA 或不含 EDTA）兼容——可搭配 Thermo Scientific Pierce 细胞裂解试剂及其他基于去垢剂的商用或自制裂解液使用 对蛋白酶和磷酸酶的广泛有效抑制三种市售蛋白酶抑制剂片剂的性能比较。在含或不含 EDTA 且分别添加了 Thermo Scientific Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂、Roche™ Complete™ 蛋白酶抑制剂片剂、Sigma-Aldrich™ SIGMAFAST™ 蛋白酶抑制剂混合物片剂的情况下，胰腺提取物（100 μL；0.5 μg/μL）与猝灭的荧光胰蛋白酶、半胱氨酸、金属蛋白酶和组织蛋白酶裂解底物一起孵育。37°C 下孵育1小时，并在相应的发射波长下测定荧光信号。图片显示了各种蛋白酶抑制剂配方的抑制效率。 Thermo Scientific 磷酸酶抑制剂迷你片剂大幅度保持了细胞提取物中的蛋白磷酸化。(A) 对 HCT116 细胞进行血清饥饿处理，用 EGF 刺激15分钟，或留作对照细胞。在 Thermo Scientific Pierce IP 裂解缓冲液中，以 Thermo Scientific 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂、不含 EDTA 或者不使用抑制剂的情况下，制备细胞裂解物。将包含 500 μg 蛋白的裂解物与 5 μg 磷酸酪氨酸抗体在 4ºC 下孵育过夜。然后将抗体复合物与 Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠在室温下孵育1小时。漂洗磁珠并在低 pH 值下洗脱。洗脱物通过蛋白免疫印迹进行检测，使用 EGFR 抗体检测膜后进行化学发光检测。（B）在分别添加 Pierce 磷酸酶抑制剂迷你片剂、Roche™ PhosStop™ 磷酸酶抑制剂片剂以及 Sigma-Aldrich™ 磷酸酶抑制剂混合液2和3的配方情况下，通过将提取物与可测量磷酸酶活性的荧光底物（MFP 或 FDP）一起孵育，从而测定肾脏提取物（25μL；0.5 μg/μL）中对蛋白磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的抑制程度。37°C 下孵育1小时，并在相应的发射波长下测定荧光信号。图片显示了各种磷酸酶抑制剂配方的抑制效率。 小贴士细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。大多数研究人员会使用几种不同抑制剂的混合物，以确保蛋白提取物在感兴趣靶标分析之前不被降解。蛋白酶抑制剂基本在所有蛋白提取中都需要使用，而磷酸酶抑制剂仅在研究磷酸化状态时才需要使用。通过 SDS-PAGE 分析溶解蛋白和不溶性组分样品，可测定所用蛋白提取方法的效率。 蛋白提取和蛋白酶抑制剂产品选择指南 组织和细胞裂解 产品选择指南产品哺乳动物细胞蛋白提取T-PER 组织蛋白提取试剂N-PER 神经元蛋白提取试剂M-PER 哺乳动物总蛋白提取试剂RIPA 裂解液IP 裂解液昆虫蛋白提取I-PER 昆虫细胞蛋白提取试剂细菌细胞裂解B-PER Complete 细菌蛋白提取试剂B-PER 细菌蛋白提取试剂B-PER (PBS) 细菌蛋白提取试剂B-PER II (2X) 细菌蛋白提取试剂植物蛋白提取植物总蛋白提取试剂盒酵母菌蛋白提取Y-PER 酵母蛋白提取试剂亚细胞组分分离NE-PER 核蛋白和胞浆蛋白提取试剂亚细胞蛋白组分分离试剂盒（组织或培养细胞）Syn-PER 突触蛋白分离试剂盒膜蛋白提取与分离GPCR 提取和稳定试剂Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒细胞表面蛋白分离试剂盒细胞器分离组织和培养细胞溶酶体富集试剂盒使用磁珠进行细胞器分离线粒体分离试剂盒（组织或培养细胞）神经元细胞蛋白提取N-PER 神经元蛋白提取试剂Syn-PER 突触蛋白分离试剂盒 用于溶解蛋白的去垢剂 产品选择指南产品用于溶解蛋白的去垢剂Surfact-Amps 去垢剂n-十二烷基-β-麦芽糖苷去垢剂CHAPS 去垢剂（3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐）十二烷基硫酸钠 (SDS)辛基硫代葡萄糖苷 (OTG) 去垢剂辛基-β-葡萄糖苷去垢剂 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 产品选择指南产品蛋白酶和磷酸酶抑制剂蛋白酶液态浓缩液、片剂和胶囊Halt 蛋白酶抑制剂浓缩液Halt 蛋白酶抑制剂浓缩液，不含 EDTAPierce 蛋白酶抑制剂片剂Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂Pierce 蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTAPierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTAPierce 蛋白酶抑制剂 XL 胶囊，不含 EDTA磷酸酶液态浓缩液和片剂Halt 磷酸酶抑制剂浓缩液Pierce 磷酸酶抑制剂片剂蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合型液态浓缩液和片剂Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂浓缩液Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂浓缩液，不含 EDTAPierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTA了解有关细胞裂解和组分分离的更多信息了解有关蛋白酶和磷酸酶抑制的更多信息 |
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