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CRISPR-Cas基因编辑技术，被誉为基因剪刀，它依托于细菌和古细菌的适应性免疫系统CRISPR-Cas的衍生，近年来在各个领域都取得了巨大进展。

近日，北京化工大学生命学院冯越课题组在Nature Chemical Biology在线发表了题为AcrIF5 specifically targets DNA-bound CRISPR-Cas Surveillance Complex for inhibition的研究论文，文章报道了Csy-dsDNA-AcrIF5的冷冻电镜结构及AcrIF5蛋白的晶体结构，揭示了抗CRISPR蛋白AcrIF5抑制I-F型CRISPR-Cas系统的分子机制，为噬菌体和宿主之间的“军备竞争”带来了新的见解。

论文截图

图1：AcrIF5的作用机制 | 团队供图

果壳硬科技第一时间联系了冯越课题组，以下为课题组成员撰写的论文解读。

细菌VS噬菌体

细菌（Bacteria）是生物中数量最多的一类，细菌的传播可能导致疾病的发生，但也有一些细菌在生物应用领域发挥重要作用。

噬菌体（phage）是一类病毒的总称，能够感染细菌，真菌等微生物，部分噬菌体能够引起宿主菌体裂解。CRISPR-Cas系统，则是原核生物进化出的一种适应性免疫系统，用来抵御噬菌体等外源核酸的入侵。

与此同时，噬菌体也进化出了多种方式，以抵抗CRISPR-Cas系统。研究人员在噬菌体中发现了能够拮抗细菌CRISPR-Cas系统并使其失活的蛋白质，将其命名为“Anti-CRISPR”蛋白（Acrs）。Acr基因最早发现于铜绿假单胞菌噬菌体中，这些噬菌体基因编码抵抗I-F型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白[1]。

I-F 型CRISPR-Cas系统

的作用机制以及I-F型Acr蛋白

I-F型CRISPR-Cas系统是I型CRISPR-Cas系统的典型代表，在细菌中广泛存在。I-F型CRISPR-Cas系统主要由核酸酶Cas2/3以及Csy复合物组成。Csy复合物又称“监视复合物”，由Cas8f，Cas5f，Cas6f，6个Cas7f亚基，以及一段crRNA组装成分子量为350 kD的复合物，可识别外源DNA，之后通过招募核酸酶Cas2/3对外源DNA进行切割，从而抑制噬菌体的感染。

截至目前，针对I-F型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白共有24种，其中，AcrIF1/2/6/8/9/10/14与Csy直接结合，抑制Csy复合物对外源DNA的识别；AcrIF3则模拟Csy的Cas8f亚基中负责与Cas2/3核酸酶结合的螺旋束(Cas8f-HB)，与Cas2/3结合后阻止Cas2/3被Csy复合物的正常招募[2]。

AcrIF5的独特性

与AcrIF5作用机制的揭示

AcrIF5蛋白是首批鉴定出的5个Acr蛋白之一。研究表明，AcrIF5是活性较弱且通常不单独存在，主要与AcrIF3蛋白共存，并且表现出CRISPRi+的表型[3]，其抑制机制一直未被解析。

2020年，冯越课题组即发现AcrIF5不能与Csy复合物或者Cas2/3核酸酶稳定结合[4]，由此推测其极有可能以一种独特的方式发挥对I-F型CRISPR-Cas系统的抑制。

在本研究中，冯越课题组首先确定了AcrIF5与Csy-dsDNA的结合，利用冷冻电镜技术解析了Csy-dsDNA-AcrIF5复合物的结构，同时解析了AcrIF5的晶体结构。

有趣的是，在复合物结构中，AcrIF5以五聚体的形式结合在Csy复合物中由Cas7f亚基构成的“腹部“区域，同时Cas8f亚基中负责招募Cas2/3核酸酶的螺旋束（Cas8f-HB）部分的电子密度消失。

在对结构进一步分析时，他们发现AcrIF5.3/5.4会与Csy-dsDNA中的Cas8f-HB产生严重的空间位阻，最终的结果证明，AcrIF5通过将负责招募Cas2/3核酸酶的Cas8f-HB由“锁定状态”变为“自由摆动状态”而发挥抑制作用。后续的Pulldown和Cas2/3招募实验证明，AcrIF5的确可以与Cas8f-HB竞争结合Csy-dsDNA的主体，从而抑制Cas2/3的招募，由此提出了AcrIF5的工作机制（图1）。

除此之外，研究组还对已知的32种含有AcrIF5基因的基因组进行生物信息学分析，结果表明，AcrIF5基因不单独存在、而是与AcrIF3等基因共存。结合Cas2/3的招募实验，他们提出了在抑制Cas2/3招募的过程中，AcrIF3主导，而AcrIF5对AcrIF3起到功能上的补充作用的共同作用模式（图2）。

图2：AcrIF5与AcrIF3共同作用 | 团队制图

冯越教授总结道，AcrIF5是目前报道的首个通过特异性靶向Cas蛋白-外源核酸复合物而不是Cas蛋白复合物本身，来发挥抑制作用的Acr蛋白。AcrIF5可竞争Cas8f-HB的结合位置，对AcrIF3抑制Cas2/3核酸酶招募发挥补充作用，通过与AcrIF3的共同作用，实现对Cas2/3核酸酶招募的抑制。

致谢

清华大学杨茂君教授在电镜结构解析中提供大量指导，电镜数据和晶体衍射数据收集分别得到南方科技大学冷冻电镜中心和上海光源的大力支持。

冯越研究组一直致力于利用结构生物学、生物化学、细胞生物学等多种手段研究病原与宿主相互作用的分子机理。目前以通讯作者身份在Nature、Nat. Chem. Biol.、Mol. Cell、Nat. Plants、Nat. Commun.等杂志发表论文多篇。课题组长期招收博士后及博硕士研究生，欢迎感兴趣的同学加盟或来函咨询 ([email protected])。

参考文献

[1] Bondy-Denomy J, Pawluk A, Maxwell K L, et al. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system [J]. Nature, 2013, 493(7432): 429-432.

[2] Rollins M F, Chowdhury S, Carter J, et al. Structure Reveals a Mechanism of CRISPR-RNA-Guided Nuclease Recruitment and Anti-CRISPR Viral Mimicry [J]. Mol Cell, 2019, 74(1): 132-142.e5.

[3] Bondy-Denomy J, Garcia B, Strum S, et al. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins [J]. Nature, 2015,526:136-139

[4] Niu Y, Yang L, Gao T, et al. A Type I-F Anti-CRISPR Protein Inhibits the CRISPR-Cas Surveillance Complex by ADP-Ribosylation [J]. Mol Cell, 2020, 80(3): 512-24.e5.

作者：冯越课题组

编辑：酥鱼

排版：尹宁流

题图来源：Science Photo Library, NTB scanpix / CC BY-NC-SA 4.0(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.no)

研究团队

通讯作者 冯越：北京化工大学生命学院教授，博士生导师。2013年于清华大学获得博士学位。2018年获得国家自然科学基金委“优秀青年科学基金”资助。曾获得全国青年岗位能手（2020）、北京市优秀青年人才（2020）、北京市科学技术进步奖二等奖（2018）、中国十大新锐科技人物（2018）、北京市科技新星（2019）等。

共同第一作者 解永超、张来幸、高政宇

论文信息

发布期刊 《自然·化学生物学》Nature Chemical Biology

发布时间 2022年3月18日

论文标题AcrIF5 specifically targets DNA-bound CRISPR-Cas Surveillance Complex for inhibition

（DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-022-00995-8）

原标题：《冯越教授课题组成果：揭示了一种抗CRISPR蛋白抑制基因编辑“剪刀手”的机制》

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