从今天开始给大家分享Western blot的操作方法，内容有点多，就分4次撰写好了。首先需要明确你需要提取的是组织蛋白还是细胞蛋白。组织提取和细胞提取只是前面的操作步骤不一样，后续都是一样的。那么我们先从组织蛋白提取开始。

    以肝脏组织为例，取冷冻肝脏组织50 mg，加入200~400 μL RIPA裂解缓冲液(RIPA裂解缓冲液∶PMSF∶protein phosphatase inhibitor =100∶1∶1)，于细胞超声破碎仪中破碎3 min（样品多可以使用全自动样品冷冻研磨仪，一次性可以研磨48或者96个样品，使用时管子里面需要加2颗适配的钢珠），提取肝脏组织蛋白，4 ℃12000 r/min离心15min，取蛋白上清液。注意全过程保持在冰上操作或者4 ℃环境下，防止蛋白降解。

    对于细胞来说，提取预冷PBS，使用预冷PBS润洗细胞3次，随后加入200~400 µL RIPA裂解缓冲液(RIPA裂解缓冲液∶PMSF∶protein phosphatase inhibitor =100∶1∶1)破碎3 min，尽量使每个细胞能够接触到裂解液。使用细胞刮刀将培养皿中的细胞尽数刮下，于细胞超声破碎仪中破碎3 min。样品多的话可以使用全自动样品冷冻研磨仪。得到的包含细胞的样品于4 ℃12000 r/min离心15 min，取蛋白上清液。注意全过程保持在冰上操作或者4 ℃环境下，防止蛋白降解。

    上面讲的就是细胞蛋白和组织蛋白提取的不同之处，后面的操作就一模一样了。随后可以对提取的蛋白进行定量操作了，可以使用BCA蛋白试剂盒进行定量。首先是标准曲线的制备：配置500，400,300,200,100,50,25,0 ug/mL不同浓度的标准蛋白溶液（使用PBS对标准蛋白进行稀释即可，倍半稀释，经常看到有人一个一个的配，配下来标准曲线2个9都没有，必须3个9以上才行），在96孔板中每孔加入20 μL标准蛋白溶液，每个浓度设一个复孔。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书，按照A∶B = 1∶50配置工作液。每孔加入200 μL工作液，37 ℃孵箱孵育20 min，酶标仪中570 nm下检测吸光值。根据吸光值和标准蛋白浓度绘制标准曲线。

    以此数据为例：

    在更多选项可以设置显示公式和R平方（相关系数）。根据得到的公式，以及样品的吸光度，可以计算出样品的浓度。

    样品浓度计算：为保证检测的蛋白吸光值在标准曲线范围之内，将样品稀释10倍、20倍（浓度太大可以稀释50倍，一般第一次做都需要摸索一下稀释倍数，后面重复实验就可以直接使用摸索的稀释倍数了）后进行检测。96孔板每孔加入20 μL样品，每个样品设置两个复孔。另外设置空白对照孔，每孔加入20 μL PBS。随后每孔加入200 μL工作液，37 ℃孵箱孵育20 min，酶标仪中570 nm下检测吸光值。将吸光值代入标准曲线中，计算样品的蛋白浓度。根据计算所得的样品中的最低蛋白浓度，用RIPA裂解缓冲液将蛋白浓度调整为一致，使各种蛋白浓度保持一致。

    以上就是组织蛋白和细胞蛋白提取和定量计算方法了。在提取组织蛋白时有一个小技巧，就是在分装时可以提前把组织称好放到1.5 mL EP管中并保存于-20℃或-80℃冰箱中，后面可以直接加裂解液提取。提取操作尽量在4个小时以内完成，时间越长蛋白降解的风险越大，尤其是新手刚开始不要一次性提太多，我见过的新手刚开始提蛋白花费时间都是6个小时起步。

    方法步骤就是以上了，大家有什么不清楚的可以私聊我，有不对的也请赐教，下次分享正式操作。留言板