（原文地址：The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013）

2013年诺贝尔生理学或医学奖授予詹姆斯·E.罗斯曼（James E. Rothman）、兰迪·W.谢克曼（Randy W. Schekman）和托马斯·C.苏德霍夫（Thomas C. Südhof），以表彰他们在细胞内主要运输系统的囊泡转运调控机制方面的重要发现（for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic）。这改变了我们对真核细胞如何组织分子在各种细胞内目的地之间，以及到细胞外的囊泡打包和运输的认识。分子货物的准确传送对细胞功能和生存至关重要。例如，这种特异性是神经递质释放到神经细胞的突触前区，并向相邻神经细胞传递信号所必需的。同样，激素如胰岛素从细胞表面释放也需要这种特异性。尽管人们早就知道细胞内的囊泡是这一运输方案的关键组成部分，但这些囊泡如何找到正确的目的地，以及它们是如何与细胞器或细胞膜融合以释放货物的，这一机制一直是个谜。2013年三位诺贝尔奖得主的工作彻底改变了我们对细胞生理学这一方面的理解。兰迪·W.谢克曼利用酵母遗传学发现了一组对囊泡运输至关重要的基因。他证明了这些基因对生命是必不可少的，并可以分为三类，以调控囊泡运输的不同方面。詹姆斯·E.罗斯曼采取生化方法，发现控制细胞融合的功能性蛋白复合体。囊泡和目标膜两侧的蛋白质通过特定的组合结合在一起，确保分子货物准确地送达到正确的目的地。托马斯·C.苏德霍夫对囊泡融合机制如何被调控产生了兴趣。他解析了钙离子是如何触发神经递质释放的机制，并识别出囊泡融合机制中的关键调控组件。罗斯曼、谢克曼和苏德霍夫的共同努力改变了我们对分子货物在细胞内外特定目的地运输方式的看法。他们的发现解释了细胞生物学中一个长期存在的谜题，并为这一机制紊乱可能导致的疾病，如神经性疾病、糖尿病和免疫性疾病，提供了新的见解。

引言

真核细胞与原核细胞的主要区别在于其更为复杂的细胞内组织结构。在真核生物中，特定的细胞功能被隔离在由生物膜包围的细胞核和细胞器（organelle）中。这种隔离大大提高了许多细胞功能的效率，并阻止了潜在危险的分子在细胞内自由游荡。然而，当不同的细胞过程被隔离时，一个问题就出现了。不同的隔室需要交换特定的分子（图1）。此外，某些分子需要被输出到细胞外。大多数分子太大，无法直接穿过膜，因此需要确保分子货物可以被特异性传送的机制。

长久以来，细胞隔室化（cellular compartmentalization）的神秘性一直引发科学家们的兴趣。改进的光学显微镜（light microscopy）技术有助于理解真核细胞内的组织结构，但是电子显微镜（electron microscopy）和新染色技术的出现，再加上使用差速超速离心（differential ultracentrifugation）程序进行的亚细胞分离实验（subcellular fractionation assay），使我们对细胞内部运作有了更深入的理解。阿尔伯特·克劳德（Albert Claude）、乔治·帕拉德（George Palade）和克里斯汀·德·迪夫（Christian de Duve）是这一领域的先驱，他们曾因此获得1974年诺贝尔生理学或医学奖，揭示了细胞是如何组织和隔离的。分泌蛋白（secretory protein）被显示是在内质网（endoplasmic reticulum，ER）上的核糖体（ribosome）上产生，并被运输到高尔基体（Golgi complex，以1906年诺贝尔奖得主卡米洛·高尔基[Camillo Golgi]命名）（图1）。在揭示蛋白质如何找到合适目的地方面也取得了进展。古特·布洛伯尔（Günter Blobel）1999年获得诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他发现蛋白质具有用于控制其在细胞内的运输和定位的内在信号。然而，一个问题仍然悬而未决。分子（包括激素、运输蛋白和神经递质）如何准确地被引导到适当的目的地呢？从帕拉德的工作中，我们了解到分泌蛋白从ER的运输是通过使用从一个膜上出芽并与另一个膜融合的小囊泡（vesicle）来完成的，但这一过程中如何获得精确性仍然是一个谜。

通过酵母遗传学发现囊泡融合相关基因

兰迪·W.谢克曼（Randy W. Schekman）曾与阿瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg，1959年诺贝尔奖得主）一起接受生物化学训练，但他决定利用酵母遗传学（yeast genetics）而非生物化学，来研究膜和囊泡运输的机制。谢克曼意识到面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）能分泌糖蛋白，这一可用于基因研究的生物因此也适合研究囊泡运输和融合。谢克曼设计了一个基因筛选方案，以识别调控细胞内物质运输的基因。他推断某些突变可能是致命的，为规避这一问题，他使用了温度敏感的突变体，并筛查影响细胞内分泌酶积累的基因（1-3）。

在初步筛选中，谢克曼获得两个基因，sec1和sec2。而在进一步细化筛选后，他发现了另外23个基因（2）。重要的是，这23个基因可以被分为三个不同的类别，基于从内质网（ER）、高尔基体或在sec1的特定状态下至细胞表面运输受阻所导致的膜积累（2）（图2）。然后，通过影响分泌系统的突变体，确定了酵母糖蛋白输出中一系列翻译后事件（3）。通过对这些突变体进行后续的遗传学和形态学研究，谢克曼发现了内质网和高尔基体之间运输的囊泡中间体（vesicle intermediate）（4）。重要的是，sec17和sec18突变体中积累了小囊泡，暗示它们在囊泡融合中起作用。

通过识别囊泡运输的关键调控基因，谢克曼为囊泡运输和融合提供了遗传学基础。他系统地揭示了涉及囊泡运输以及囊泡与目标膜交互的分泌途径中的事件（图2）。

生化之旅：识别融合过程中的关键蛋白

詹姆斯·E.罗斯曼（James E. Rothman）在斯坦福大学作为年轻的研究组长时，采用了一种新颖的方法。他开发了一个体外重建试验（in vitro reconstitution assay），以分析细胞内囊泡运输中涉及的事件。使用这一方法，他纯化了囊泡融合（vesicle fusion）过程的基本组分。考虑到在20世纪70年代，表达动物细胞中的基因是困难的，罗斯曼利用了他在麻省理工学院哈维·罗迪什（Harvey Lodish）实验室学到的基于水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的系统。在这一系统中，感染细胞会大量产生特定的病毒蛋白——VSV-G蛋白。这个系统的一个独特特点是，当VSV-G蛋白到达高尔基体时，会被特定的糖基化修饰标记，从而可以确定它到达了目的地。罗斯曼发表了一系列论文，其中他重建了VSV-G蛋白在高尔基体内的细胞内运输（5-8）。然后，他用该试验来研究囊泡的成熟和融合，并从细胞质中纯化了运输所需的蛋白。首个被纯化的蛋白是 N-乙基马来酰亚胺敏感因子（N-ethylmaleimide-sensitive factor，NSF）（9-11）。

罗斯曼发现 NSF 为后来识别其他对囊泡融合控制起重要作用的蛋白铺平了道路，紧接着出现的是可溶性NSF-附着蛋白（soluble NSF-attachment protein，SNAP）（12）。SNAP能结合到膜上，并协助招募NSF。谢克曼和罗斯曼的工作之间的一个重要交汇点是发现其中一个酵母突变体sec18对应于NSF（13,14），这也表明囊泡融合机制是进化上古老的。此外，罗斯曼和谢克曼合作克隆了 sec17，并提供了它与 SNAP 功能等价的证据（15）。其他sec基因被证实与编码融合蛋白的基因对应，这些是通过其他方法识别出来的。

利用NSF和SNAP蛋白作为诱饵，罗斯曼接下来转向了脑组织，从中纯化出他后来命名为SNARE（可溶性 NSF-附着蛋白受体）的蛋白质（16）。令人振奋的是，三种SNARE蛋白，即VAMP/突触泡蛋白（synaptobrevin）、SNAP-25和合成素（syntaxin），以相当数量存在，这让罗斯曼认为它们在囊泡和目标膜中共同起作用。这三种蛋白质之前已经被包括理查德·舍勒（Richard Scheller）、赤川公朗（Kimio Akagawa）、莱因哈德·亚恩（Reinhard Jahn）和彼得罗·德卡米利（Pietro de Camilli）在内的几位科学家发现，并定位在突触前区（presynaptic region），但它们的功能基本上是未知的。VAMP/突触泡蛋白存在于囊泡中，而SNAP-25和合成素则位于细胞膜上。这促使罗斯曼提出一个假说——即SNARE假说（SNARE hypothesis），它包含目标和囊泡的SNARE（分别为t-SNARE和v-SNARE）通过一系列突触对接、激活和融合的一系列步骤对囊泡融合至关重要（16）。

为了检验SNARE假说，罗斯曼使用了一个体外重构试验，揭示SNARE确实能够促成膜融合（17）。他提供了证据，表明该系统具有很高的特异性，即特定的t-SNARE只与少数可能的v-SNARE中的一个或几个发生相互作用（18）（图3）。SNARE假说对于推动这一研究领域具有重要意义，尽管多个研究小组在机制上对其进行了完善，但假说的核心——强调v-SNARE和t-SNARE之间的相互作用，经受住了时间的考验。

罗斯曼剖析了囊泡运输和膜融合的机制，并通过生化研究提出了一个模型，以解释囊泡融合是如何特异性地发生的（图3）。

发现控制囊泡融合时序的基因

托马斯·C.苏德霍夫（Thomas C. Südhof）最初在德国哥廷根的乔治-奥古斯都大学和马克斯-普朗克生物物理科学研究所接受培训，后成为德克萨斯大学西南医学院的迈克尔·布朗（Michael Brown）和约瑟夫·戈尔斯坦（Joseph Goldstein）（1985年诺贝尔奖得主）的博士后研究员。作为一个年轻的研究组长，他开始研究突触囊泡融合是如何受到控制的。虽然罗斯曼和谢克曼提供了囊泡融合的基础机制，但囊泡融合的时间控制仍然是个谜。身体内的囊泡融合需要谨慎控制，而在某些情况下，需要对特定刺激作出高度精确的囊泡融合反应。这种情况例如存在于大脑中的神经递质释放和内分泌胰腺中的胰岛素分泌。

神经生理学领域因伯纳德·卡茨（Bernard Katz）、乌尔夫·冯·奥伊勒（Ulf von Euler）和朱利叶斯·阿克塞尔罗德（Julius Axelrod）的发现而兴奋不已，他们因发现关于神经末梢的体液传递物及其储存、释放和失活的机制而于1970年获得了生理学或医学诺贝尔奖。苏德霍夫对由细胞质自由钙浓度变化调控的突触囊泡的快速外排（exocytosis）感到着迷。苏德霍夫阐明了钙是如何调控神经元中神经递质的释放，并发现复合素（complexin）和突触结合蛋白（synaptotagmin）是钙介导的囊泡融合中两个关键蛋白质（图4）。

复合素与α-SNAP竞争以结合SNAP受体，但不与突触结合蛋白竞争（19）。来自复合素敲除小鼠的神经元表现出因突触分泌过程的钙敏感性降低而导致的递质释放效率显著下降（20）。这揭示了复合素在突触融合的后期阶段作为一种钳制机制，阻止自发融合并允许受控的外排发生（20）。苏德霍夫还发现了突触结合蛋白-1（21），该蛋白质将钙与神经递质释放耦合（22）。突触结合蛋白-1在钙依赖性的方式下与磷脂以及合成素-1和SNARE相互作用，并且苏德霍夫通过优雅地展示钙与突触结合蛋白-1的结合参与触发突触处神经递质的释放（23），确立了突触结合蛋白-1作为快速突触融合的钙传感器的角色。

苏德霍夫也鉴定了Munc18-1，这一蛋白与谢克曼的sec-1对应，因此也被称为SM蛋白（Sec/Munc的缩写）。发现Munc18-1与合成素相互作用（24），并且后来也与Trans-SNARE复合体结合。现在已知SM蛋白是与SNARE蛋白一起构成囊泡融合蛋白质复合体的一个不可或缺的部分。苏德霍夫证明，在小鼠中删除Munc18-1会导致突触囊泡中神经递质分泌的完全丧失（25）。

苏德霍夫的关键性发现推动了我们对囊泡融合时序控制的理解，他阐明了钙水平如何调控突触处神经递质释放（图 4）。

囊泡融合及其对医学的重要性

罗斯曼、谢克曼和苏德霍夫的工作揭示了对于生物体中细胞内货物定向至关重要的机制，这一机制在从酵母到人这样相距遥远的生物中都是通用的。这些发现极大地影响了我们对分子如何被准确地分类到细胞内特定位置的理解。有鉴于此，毫无疑问，控制囊泡运输和融合的机制中的任何一个步骤出现缺陷都与疾病有关。

囊泡运输和融合对于从大脑中的神经细胞通信控制到免疫反应和激素分泌等生理过程至关重要。运输系统的失调与这些领域的疾病有关。例如，代谢性疾病如 2 型糖尿病是由胰岛β细胞中胰岛素分泌缺陷和骨骼肌及脂肪组织中胰岛素介导的葡萄糖转运体转位缺陷共同特征的。此外，我们体内的免疫细胞依赖于正常的囊泡运输和融合，以发送包括细胞因子和免疫效应分子在内的物质，这些物质介导先天和适应性免疫反应。

除了这些囊泡融合与疾病之间的一般关联外，囊泡融合机制中蛋白质编码基因的特定突变导致了多种疾病。例如，在某些类型的癫痫中，描述了编码MUNC-18-1的基因突变。同样，在遭受家族性血吸细胞性淋巴组织细胞性增生症（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，FHL）的患者亚群中，发现了MUNC13-4、MUCH18-2和合成素-11基因的突变。在FHL患者中，天然杀伤细胞（natural killer cell）在遇到靶细胞时无法正确调控，导致过度炎症（hyperinflammation），这可能是致命的。此外，某些细菌毒素针对囊泡融合机制。由厌氧细菌肉毒杆菌（Clostridium botulinum）引起的肉毒杆菌症（botulism）是一种瘫痪性疾病，其毒素主要类型切割SNAP-25、VAMP/突触泡蛋白和合成素，从而抑制在神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放（26）。破伤风神经毒素（tetanus neurotoxin，来自破伤风杆菌Clostridium tetani）针对抑制性中间神经元（inhibitory interneuron）中的VAMP/突触泡蛋白，并阻止GABA或甘氨酸的释放，导致痉挛性瘫痪（spastic paralysis）（26）。因此，罗斯曼、谢克曼和苏德霍夫的发现为疾病机制和潜在治疗提供了清晰的认识。

结论

詹姆斯·E.罗斯曼（James E. Rothman）、兰迪·W.谢克曼（Randy W. Schekman）和托马斯·C.苏德霍夫（Thomas C. Südhof）的发现阐明了真核细胞中一些最基础的过程，这些过程共同确保了分子货物被正确地定向。他们的发现对我们理解细胞内外分子如何被精确地分类到特定位置产生了重大影响。在生物体中，囊泡运输和融合按照相同的基本原理运作，即使这些生物体彼此不同，如酵母和人。这一过程对于一系列必须控制囊泡融合的生理过程至关重要，从激素或神经递质的释放到免疫系统的功能。一旦没有这种精确的系统，细胞将陷入混乱。

Juleen R. Zierath和Urban Lendahl，卡罗林斯卡学院

Juleen R. Zierath

临床整合生理学教授，卡罗林斯卡学院

诺贝尔委员会主席

诺贝尔大会成员

Urban Lendahl

遗传学教授，卡罗林斯卡学院

诺贝尔委员会兼职成员

诺贝尔大会成员

插图：Mattias Karlén

参考文献

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