点评 | 俞立（清华大学）、陈良怡（北京大学）

线粒体作为最重要的细胞器之一，是细胞的能量工厂、代谢中心及胞内关键的信号整合场所。线粒体的质量控制和数量调控对于细胞功能都至关重要。除线粒体自噬外，目前尚不清楚是否存在其他生物学过程用以降低细胞内线粒体的数量。精子中线粒体数量是否受到严格调控是生殖领域内长期关注的一个关键问题。过去一些观察发现，不同弱精症患者的精子存在线粒体数量过多或过少的情况，这暗示精子中线粒体数量维持在一个合适的范围可能对于精子可育性非常重要。近年来，随着男性不育发病率的逐年提高，线粒体功能或数量改变对男性不育症的影响进一步引起了科学家的广泛关注，然而目前相关机制研究仍然非常有限。

2023年11月9号，西湖大学生命科学学院唐鸿云团队与北京大学跨学部生物医学工程系黄小帅团队合作，在Nature Cell Biology发表了题为 Mitopherogenesis, a form of mitochondria-specific ectocytosis, regulates sperm mitochondrial quantity and fertility 的最新研究成果。利用模式生物秀丽隐杆线虫（C. elegans），他们首次鉴定到了一种特异性包裹线粒体的细胞外囊泡，并将该囊泡命名为“线粒体囊(mitopher) ”。“线粒体囊”的产生（mitopherogenesis）是精子中线粒体数量调控的主要机制，可能关键性调控精子的能动性和可育性。该原创性发现为理解精子发育中线粒体数量控制、不同细胞间线粒体交流及胞外囊泡的新功能带来全新的理解。

（一）精子发育过程中，其胞内线粒体数量受到严格调控

为了解析雄性配子中线粒体数量是否需要维持在一个相对恒定的范围，作者通过荧光染色及三维电镜两种成像手段对秀丽隐杆线虫雄虫生殖腺中正在完成第二次减数分裂的精细胞和成熟精子中线粒体含量和数量进行了分析，他们发现成熟精子中的线粒体总体积明显低于精细胞，并且线粒体数量也显著减少（图1）。通过三维电镜定量细胞内线粒体的绝对数量，结果显示平均每个成熟精子中含有57个线粒体，而精细胞中约含有90个线粒体，平均减少了33个线粒体（图1）。这些结果证明线虫精子发育过程中，其线粒体数量受到严格调控，维持在一个合适范围内。由于线虫的精细胞中不含有溶酶体，因此常用的线粒体清除方式—线粒体自噬无法解释精细胞发育过程中线粒体数量的明显下降。这一结果提示在精子发育过程中，可能存在其它方式来调节线粒体数量。

图1. 正在完成第二次减数分裂的精细胞和成熟精子中线粒体体积和数量统计

（二）精细胞生成线粒体囊将线粒体外排至细胞外空间

既然线虫精子发育过程中大约三分之一的线粒体“消失”了，那么精细胞到底是以什么方式减少其内线粒体数量的？通过透射电子显微镜（TEM）和三维电子显微镜（3D-EM）等先进成像技术，研究人员惊奇地发现在精细胞胞外空间存在一种以前未被定义的特异性含有单个线粒体的细胞外囊泡，作者将其命名为“线粒体囊(mitopher)” (图2)。此外，研究人员通过多种先进的活体成像技术观察到了精细胞囊吐（ectocytosis）产生“线粒体囊”的动态过程。他们发现细胞质膜首先形成向外的芽突，包裹一个健康的线粒体，然后迅速芽吐生成“线粒体囊”。（注：此处“囊吐”和“芽吐”为西湖大学唐鸿云研究员和北京师范大学苗龙研究员分别对“ectocytosis”和“细胞膜出芽(budding) 形式发生的ectocytosis”共同做的中文注释）。线粒体囊与之前报道过的另外两类携带细胞器的囊泡，迁移体(migrasome)及exopher，在生物合成机制，生成速度，大小及货物特异性上有明显区别，因此是一类全新的包裹细胞器的囊泡 (图3)。那么“线粒体囊”的产生，是否是精细胞线粒体数量调控的最主要方式呢？为了回答这个关键问题，文章共同一作盛丹莉做了大量极富创造性的尝试和优化，最终通过使用显微操作技术和流式分析相结合的方式，对单个精细胞在发育过程中产生的“线粒体囊”数量进行统计，发现平均每个精细胞可以产生约29个“线粒体囊”，即外排29个线粒体，这说明“线粒体囊”的产生是精细胞中最主要的线粒体数量调节机制。

图2. 精细胞通过芽吐生成“线粒体囊”将线粒体排出至胞外空间

图3. “线粒体囊”与迁移体及exopher的比较

（三）“线粒体囊”的发生是一个高度受发育信号调控的过程—胞外蛋白酶触发精细胞生成“线粒体囊”

在探究触发“线粒体囊”生成的体内信号时，研究人员进行了大量的突变体以及小分子筛选，最终发现了生殖腺内的蛋白酶可以作为发育信号触发精细胞释放“线粒体囊”，这一过程部分依赖于酪氨酸激酶SPE-8的作用（图4）。此外，研究人员发现参与货物转运的肌球蛋白Myosin VI在“线粒体囊”的产生过重中具有负向调控作用，而肌动蛋白Actin的聚合则是生成“线粒体囊”所必需的（图4）。这些结果为初步阐释了“线粒体囊”发生的细胞过程和分子机制。

图4. 精细胞生成“线粒体小体”的调控机制

（四）“线粒体囊”的正常产生对精子的能动性和可育性至关重要

最后，研究人员想探究“线粒体囊”的形成具有何种重要的生理意义。他们发现：与目前已知囊泡携带损伤线粒体不同，“线粒体囊”向外转运健康线粒体，其在精子线粒体数量的精确调控中起着关键作用。抑制“线粒体囊”的发生导致精子中线粒体积累，进而影响精子的运动能力和可育性。研究人员发现“线粒体囊”的产生减少的突变体精子，虽然具有正常的伪足形态，但存在很高比例的精子无法运动的情况，且这些精子中均含有更多的线粒体。因此，“线粒体囊”的产生关键性调控精子中线粒体数量，这一生物学过程的正常进行可能是精子获得能动性的前提。同时，“线粒体囊”产生减少的突变体雄虫，相比于野生型，产生的后代数明显减少，进一步证明了“线粒体囊”的正常生成对于产生可育的精子十分重要。

综上，“线粒体囊”是一种特异性包裹线粒体的细胞外囊泡。“线粒体囊”的发生代表了一种以往未描述的线粒体特异性芽吐过程，揭示了精细胞发育期间线粒体数量调控的机制。

诚如本研究的通讯作者唐鸿云研究员强调这一发现的重要性时所说：“线粒体囊及其调控机制的发现，是在现有线粒体数量调控机制上开辟出的一个新的分支。这项研究丰富了我们对线粒体行为的基础认知，也有望对精子不育提供新的机制性理解。”他随后补充道：“线粒体囊很有可能是多种细胞排出线粒体的重要方式，这些携带健康线粒体的结构很可能会在细胞间线粒体（及线粒体遗传物质）交换及信号交流过程中也发挥重要作用。”该研究为未来探索“线粒体囊”在多种生理活动中的作用开启新篇章，线粒体交换可能作为一种古老的信号交流方式有许多未知的重要功能和惊喜等待我们去发现。

西湖大学生命科学学院唐鸿云研究员和北京大学跨学部生物医学工程系助理教授黄小帅为本文共同通讯作者；西湖大学唐鸿云课题组的博士后刘朋、博士研究生时静和盛丹莉为本文的共同第一作者；其他作者包括北京大学黄小帅团队路雯清，西湖大学唐鸿云组科研助理郭杰、王晓晴、吴绍凤、冯延文以及西湖大学电镜平台高磊博士；此外，西湖大学生科院的章永登研究员，中科院生物物理所李栋教授，西湖大学生物医学技术中心王亚林、高银萍、肖芳以及蔡司显微成像工程师在荧光显微成像方面提供了帮助，于珍珍在显微操作方面提供了诸多帮助以及王亚林和方桂村在电镜方面提供了大量的技术支持。俞立、陈良怡、陈佺、苗龙、杨崇林、王晓晨、韩珉、李党生和蒋敏等专家对本研究给予了建议和帮助。西湖大学李小波研究员在mitopher翻译为“线粒体囊”中提供了建议。

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41556-023-01264-z

专家点评

俞立（清华大学生命科学学院教授）

近年来，随着胞外囊泡多种重要生理功能的发现，如关键性调节细胞稳态和代谢，其相关研究逐渐成为科学界关注的热点。细胞通过胞吐 (exocytosis) 和囊吐 (ectocytosis) 产生胞外囊泡结构，其中可包含核酸、蛋白质、代谢产物以及细胞器等成分。携带细胞器的胞外囊泡，由于其货物的特殊性受到了广泛的关注。线粒体是细胞的能量中心及许多胞内信息的转换场所，其质量和数量的维持对于细胞行使正常功能至关重要，因此胞外囊泡介导的线粒体外排作为一种新型的线粒体稳态调控机制，其重要意义不言而喻。目前已知的可外排线粒体的结构主要包括细胞在运动过程中产生的迁移体及在线虫神经元中首次发现的exopher，这两类结构通过排出受损线粒体维持胞内线粒体质量。发现新型的线粒体外排机制，并阐释其产生机制与功能非常重要，可为理解线粒体行为、囊泡功能和细胞间信号传递等提供全新视角。

西湖大学唐鸿云团队和北京大学黄小帅团队发现线虫精细胞在发育过程中可通过囊吐产生一种特异性包裹线粒体的胞外囊泡，他们将其命名为线粒体囊（mitopher）。该研究全面探究了线粒体囊的结构特点和产生过程，鉴定了触发线粒体囊从精细胞产生的发育信号，明确阐述了线粒体囊与目前已知的包含线粒体的其他囊泡在多种方面存在差异，是一种全新的携带线粒体的囊泡。功能研究中，他们发现线粒体囊的发生在精子发育过程中关键性地调控线粒体数量，并可能影响精子的能动性及可育性，具有十分重要的生理意义。

该研究中有诸多亮点：

（1）线粒体囊的发现是胞外囊泡认知上的重要突破，线粒体囊仅包含单个健康线粒体，在货物上具有高度的特异性和统一性，这与目前已知的往往包含多种物质和细胞器的胞外囊泡存在明显差异，暗示可能存在特定的货物筛选机制参与线粒体囊的产生并且这些囊泡可能执行特殊功能。此外，不同于现有的受损线粒体以囊泡形式排出从而对细胞内线粒体质量进行调控的研究，线粒体囊中的线粒体是健康的，首次证明了囊泡通过外排健康线粒体来调控线粒体数量的概念，这对于某些需要精准控制线粒体数量的细胞，如精细胞，十分重要。因此，该项研究为囊泡功能的拓展带来了新视角，具有十分重要的意义。

（2）线粒体囊生成的动态过程也格外有趣。胞外囊泡的产生有多种方式，例如迁移体，在细胞迁移过程中拉出伸缩丝，之后在伸缩丝上形成具有囊泡结构的迁移体，整个过程通常需要40-200分钟；另一类包含线粒体的胞外囊泡—exopher，则会通过胞体细胞膜外凸并释放的方式形成囊泡，这个过程通常需要15-60分钟。而线粒体囊则通过细胞膜形成包含线粒体的芽突并快速脱落的方式产生，整个过程仅持续几秒钟。在如此短的时间内，细胞能够调动胞内各个组分来完成囊泡的形成，这其中动力学机制令人好奇。将来对线粒体囊生成过程细节机制的全面解析对于理解不同类型的囊泡的产生机制提供了全新的可能性。

（3）线粒体囊的研究没有现存的技术体系，困难重重。研究人员突破了技术限制，通过光学成像，三维电镜重构，显微操作定量分离原代精细胞，继而诱导线粒体囊的产生，并利用流式分析所产生的线粒体囊的数量等方法清晰阐释了线粒体囊产生的细胞过程，为未来领域内其他科学家研究线粒体囊奠定了重要基础。

线粒体囊通过细胞出芽（outward bud）方式快速产生，是一类全新的胞外囊泡结构。线粒体囊的发现填补了目前关于携带特定细胞器的囊泡的认知空白，为未来研究特异性包含其他细胞器的囊泡奠定了基础。线粒体囊包含健康的线粒体，该结构特殊性可能暗示其或在其它重要细胞过程如细胞间线粒体交流和通讯中也发挥重要作用，可能开拓线粒体特异交换这一新领域，因此未来对线粒体囊的研究可能阐释线粒体质量和数量调控及线粒体行调控的新机制。总的来说，线粒体囊的发现为领域内理解胞外囊泡种类、产生机制及功能提供了全新的角度。

专家点评

陈良怡（北京大学长聘教授、未来技术学院、IDG麦戈文脑科学研究所PI）

近年来，细胞外囊泡的研究方兴未艾。细胞外囊泡不仅可以参与维持自身细胞稳态，还可以实现细胞间的通信，在各种生理和病理过程中扮演重要的角色。随着研究的深入，人们发现细胞外囊泡远比之前所认知的要更为复杂和多样。新的分离、分析方法的出现以及显微成像技术的进步也为研究人员鉴定出新的细胞外囊泡类型提供了条件。近日，西湖大学唐鸿云团队与北京大学黄小帅团队应用光镜和三维电子显微镜（3D-EM）研究线虫雄性生殖腺中精子发育过程，发现了一种全新的、特异性包裹线粒体的细胞外囊泡，并命名为线粒体囊（mitopher）。该发现揭示了胞外囊泡调控胞内线粒体含量的新功能，为不同细胞间线粒体交流及精子发育中线粒体数量控制带来新的理解。

线粒体囊与已报道的其它携带线粒体的细胞外囊泡，如迁移体(migrasome)和Exopher，在生成机制、产生速度、囊泡大小和携带“货物”特异性等多个方面存在明显差异。特别是在生成机制和速度方面，细胞通过在细胞表面形成包含线粒体的“芽突（outward bud）”，并迅速释放囊泡，形成线粒体囊。线粒体囊生成的整个过程在几秒内就完成，与迁移体（40-200分钟）及exopher （15-60分钟）的相对缓慢的生成过程显著不同，说明了线粒体囊是一个以前未知的用于特异性外排线粒体的过程。

在体或体外实时观察线粒体囊外排过程存在诸多技术挑战。首先，精细胞体外培养条件要求高，悬浮不贴壁且对光毒性敏感。为解决上述问题，研究人员先后对体外培养条件进行了优化，包括使用水凝胶或低悬浮性的培养基固定样本不动、对共聚焦小皿采用具有粘附性的试剂孵育、优化使用低光毒性染料和荧光蛋白等，尽可能保证体外培养精细胞接近正常生理状况，增加捕捉到线粒体囊释放的几率。其次，线虫精细胞立体、大小仅5μm，且胞质内线粒体排列紧密，因此追踪线粒体囊泡产生过程中细胞内线粒体的运动轨迹非常困难。最后，线粒体易位，包含线粒体的细胞膜芽突形成及线粒体囊的脱落这一系列的过程在几秒钟内完成，记录这么短时间内的三维动态过程是极为挑战的。

这些问题恰恰是超分辨率成像领域正在尝试优化的两个关键方向：（1）超分辨率中的光毒性限制了对活细胞内精细生理进程的实时观察；（2）受制于单位时间内荧光分子所发出的光子数量，时间和空间分辨率往往难以兼得。研究人员实验发现，无论是普通共聚焦还是转盘共聚焦，在时间和空间分辨率方面都无法满足实验要求。而SIM超分辨显微镜，虽然其空间分辨率得到巨大提升，却无法平衡时间分辨率和光毒性问题。光场显微镜尽管在时间分辨率上得以改善，空间分辨率的限制仍然存在。然后，作者发现使用最新的晶格光片显微镜，当在一定程度上牺牲空间分辨率的需求时，可在分离的原代精细胞中捕捉到线粒体囊的生成过程。但由于空间分辨率的下降，无法观察到生殖腺中线粒体囊的释放过程。最终，利用超分辨荧光辅助衍射层析技术（SR-FACT），唐鸿云团队和黄小帅团队通过双模态成像成功鉴定出精子中多种亚细胞结构，并利用低光毒性、高速、三维超分辨率的光学衍射层析模式（ODT）在原代分离的精细胞及生殖腺中成功观察到线粒体囊的动态外排过程，这为其他快速形成的细胞生物学过程提供了借鉴和思考的途径。

美国小说家Laura Lippman说过：“我们不能想象我们看不见的东西。” 细胞内部尚有许多秘密等待揭示，随着我们对观察细节的深入，分辨率的提升，以及捕捉动态变化速度的能力提升，我们将可以更加深刻地理解它们的机制。

本文转载自公众号“BioArt”

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原标题：《【科技前沿】NCB丨唐鸿云/黄小帅团队发现一种全新的亚细胞结构——“线粒体囊” 及其在精子线粒体数量调控和可育性中的关键作用》

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