细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、真菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、原虫污染、病毒污染以及非细胞污染。

怎样判断你的细胞是何种生物性污染?

01、细菌

细菌种类繁多，分布广泛，是最容易污染细胞的微生物。

1、常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等(革兰阴性菌)、葡萄球菌等(革兰阳性菌)，其中革兰阳性菌较为多见。

2、主要来源：操作不当或是器材消毒不严，或是各种营养成分隐性污染细菌没有被检测出来所造成的。

3、特点：污染速度快，易被发现。多数情况下细胞培养液短时间内变黄，培养基1～2d就会变浑浊，pH值降低，倒置显微镜下观察，可见胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，呈细沙状，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动。

4、处理措施

①在培养液中添加双抗（P/S）处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；

②另外添加西司他丁钠和亚胺培南处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况。

③裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。

02、真菌

1、真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其是在梅雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

2、主要来源：实验人员(实验服)

3、特点

短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，4d左右才可在高倍镜下观察到丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间（发生卵圆形物体污染的几率很大）。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落而亡。

4、处理措施

① 添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；

② 环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。

③ 若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。

03、支原体

1、支原体是介于细菌与病毒之间(直径在0.13～0.18 μm)能独立生活的最小微生物，结构简单，多数呈球形，可穿过0.22 μm 的孔径滤膜！光镜下难以看清它的形态结构，并对青霉素有抗药性！多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

2、主要来源：血清

3、特点

支原体污染不能用肉眼或光学显微镜检查细胞观察出来，带有一定的隐蔽性，易被人们忽视。当细胞被支原体污染后，在光镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡，细胞营养液可能毫无变化，短期内细胞没有明显的病理变化，也可以因为传代或换液而缓解。只有当污染严重时才影响细胞增殖，使细胞脱落。支原体可以与宿主细胞形成一个共生关系，使污染不断扩大。

4、检测

常用的检查方法为培养检测法，即取1mL细胞培养液加入支原体液体培养基中，培养5天后，观察培养基的颜色变化。如果变黄则怀疑该细胞受到支原体污染。如果不变色，则盲传一代。

若颜色变黄，可接支原体固体培养基，于5%CO2培养箱中培养3～5天，观察有无“煎蛋”状支原体菌落。一旦发生污染即淘汰该细胞和培养液。

此外，支原体污染还可用荧光染色法和相差显微镜观察法等检测方法,或者直接购买支原体检测试剂盒进行检测。

5、处理措施

① 用MRA处理

用MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好。

② 用清洗纯化法清除支原体污染的方法

细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤

其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。

如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

③ 药物辅助加温处理

先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

④ 使用支原体特异性血清

用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

04、黑胶虫

1、黑蛟虫是一种生物还是非生物，学术界还有争论。可以穿透滤膜，也可以通过空气传播。

2、主要来源：血清

3、特点

开始污染时对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体。培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

4、处理措施：

更换血清；增加细胞密度，提高细胞的生长率。

05、病毒

1、尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

2、主要来源：动物血清或者细胞系，常见于杂交瘤细胞。

3、特点：极为隐蔽，很难用常规的方法检测到。受病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大多数受病毒污染的细胞不会产生形态变化及细胞病理现象，少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落。

4、检测：可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒。通常病毒物污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。

06、原虫

培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且 细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮 。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

07、非同种细胞污染

即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致 。

细胞一旦发现有污染出现，应及时对所用试剂和耗材进行清理。耗材可更换新的或者重新高压灭菌，试剂可重新过滤除菌或者更换新批次，操作台和细胞房需用消毒液进行全面清洁消杀后方可复苏新的细胞，以免反复出现污染。

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