3．研究思路：

3.1HDAC抑制剂使B基因mRNA上调，且使B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平升高 3

3.2组蛋白乙酰转移酶A过表达增强B基因启动子的转录活性 3

3.3B基因启动子上有A蛋白的结合,过表达A蛋白能升高细胞内源性B基因mRNA水平 4

3.4B基因启动子上的两个Sp1结合位点被确认 4

3.5乙酰转移酶A和转录因子GATA-1协同激活B基因启动子转录，B基因启动子上两个GATA-1位点对于A的功能是必要的 5

3.6乙酰转移酶A与转录因子GATA-1和Sp1协同增强B基因启动子的转录活性 7

3.1HDAC抑制剂使B基因mRNA上调，且使B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平升高

为弄清楚组蛋白乙酰化是否与B基因的转录调控有关，用HDAC抑制剂丁酸钠aBu和TSA处理cell-1细胞，培养24h后，进行RT-PCR分析。结果显示HDAC抑制剂可使B基因mRNA水平升高。

由于HDAC抑制剂是通过诱导基因启动子组蛋白高乙酰化而影响基因表达的，因此，接下来考察HDAC抑制剂对B基因的上调是否也是通过升高B基因启动子组蛋白乙酰化水平实现的。通过染色质免疫共沉淀（CHIP）实验，结果如预期所料，HDAC抑制剂处理细胞后，B基因mRNA转录上调的同时，伴随着B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平的明显升高。

3.2组蛋白乙酰转移酶A过表达增强B基因启动子的转录活性

既然B基因的表达与B基因启动子组蛋白乙酰化修饰有关，那么，到底是何种组蛋白乙酰转移酶与B基因启动子的功能直接相关呢？经过文献调查，我们推测可能是组蛋白乙酰转移酶A。为了探讨组蛋白乙酰转移酶A在B基因转录中的作用，需构建B基因启动子的报告基因质粒PGL3-E-BP(B基因promoter)。将从人类基因组克隆出来的B基因启动子片段插入萤火虫荧光素酶报告基因载体PGL3-Enhancer。

将不同量的组蛋白乙酰转移酶A表达质粒（0、0.5、1、2、3、4 μg）与1 μg报告基因质粒PGL3-E-BP瞬时转染293T细胞，培养24 h后，裂解细胞，测定相对荧光素酶活性。结果显示：组蛋白乙酰转移酶A能够以剂量依赖性的方式增强B基因启动子的转录活性。

接下来，将PGL3-E-BP、组蛋白乙酰转移酶A表达质粒和腺病毒癌蛋白E1A的表达质粒共转染293T细胞。已知E1A能够与组蛋白乙酰转移酶A的HAT区结合从而抑制A的HAT活性。结果显示：E1A确实抑制了组蛋白乙酰转移酶A对B基因启动子的激活功能。当以E1A△2-36（缺失与A结合的结构域）代替E1A时，A的作用不受影响，证明了A在激活B基因启动子的过程中，它的乙酰转移酶活性是必需的。A△HAT与报告基因质粒共转染时，对B基因启动子的转录激活作用显著减弱，更进一步明确了A的乙酰转移酶活性在B基因启动子的转录激活中是必不可少的。

注释：1）此步骤中关于组蛋白乙酰转移酶A的推断，需根据文献调研或选择不止一个可能候选者，进行逐一排查，但实验方法同上。

2）关于腺病毒癌蛋白E1A，根据组蛋白乙酰转移酶A的不同，可能会有所变化，如果无法找到可与组蛋白乙酰转移酶A的HAT区结合从而抑制A的HAT活性的蛋白，则此部分可省略。

3.3B基因启动子上有A蛋白的结合,过表达A蛋白能升高细胞内源性B基因mRNA水平

前面已证实A蛋白对B基因启动子报告基因的激活作用，A蛋白是否对內源的B基因表达也发挥作用，还需要进一步的实验来揭示。如果能发现A蛋白确实与B基因启动子结合，那将是最直接的证据。染色质免疫沉淀（CHIP）实验结果显示：在B基因启动子上确实有乙酰转移酶A蛋白存在。

在证实了A蛋白确实能与B基因启动子结合后，接下来对A蛋白激活內源B基因转录的功能进行进一步考察。用A蛋白表达质粒转染cell-1细胞，使A蛋白在cell-1细胞中过量表达，提取细胞RNA，Real-time PCR分析细胞内B基因mRNA的水平，结果显示：A蛋白过表达细胞中B基因的mRNA水平显著高于对照组，与HDAC抑制剂NaBu处理的结果相近。

3.4B基因启动子上的两个Sp1结合位点被确认

Sp1是哺乳动物遍在表达的转录因子，参与大量基因的转录调控，它能与靶基因启动子区的富含GC的元件相互作用，既能激活基因转录，又能抑制基因的转录，究竟发挥哪种作用取决于它结合的元件及与之作用的辅因子。

在B基因启动子上游-164/-158和-146/-139有2个可能的Sp1结合序列GGGAGGG，为弄清Sp1蛋白是否真的与这两个序列结合，通过电泳迁移率（EMSA）分析。

首先体外合成了包含上述两段序列的寡核苷酸链，野生型：5-CCAGAGCTGGGGGAGGGGGTACACTAGAGGGAGGGGCTACTTTGG-3；突变体：5-CCAGAGCTGGGGGAAAGGGTACACTAGAGGGAAAGGCTACTTTGG-3。以生物素标记制备探针，将Sp1表达质粒转染293T细胞，培养24 h后提取核蛋白，进行EMSA分析。结果显示：核提取物使含有2个可能Sp1位点的探针发生凝胶电泳迟滞现象；当实验体系中再加入100倍的未标记探针时，迟滞现象消失，竞争实验说明该迟滞现象确实是我们所研究的探针与核蛋白结合产生的；那么，核提取物中与探针结合的蛋白究竟是不是Sp1呢？为回答这个问题，在实验体系中加入Sp1抗体，如预期所料，由于抗体的特异性结合使探针-蛋白质复合物的质量增大，因此在电泳中发生了super-shift现象；为了证实Sp1与探针结合的位点确实是2个可能的Sp1位点，通过位点突变的探针代替野生型探针，再做EMSA实验，结果无法观察到用野生型探针时所看到的迟滞带。以上所有结果充分说明了B基因启动子上这2个相近的元件在体外能与Sp1结合。

注释：1）关于Sp1与B基因结合这部分，主要是为了后续发现做铺垫，如果课题不涉及，可以省略这部分。但是，由于Sp1可能和很多基因的启动子结合，如果您在完成前期实验后，不确定您兴趣基因的特异性转录因子，可以尝试SP1。

2）本部分对EMSA实验的设计和结果解释非常全面，可作为EMSA实验参考的范例。

3.5乙酰转移酶A和转录因子GATA-1协同激活B基因启动子转录，B基因启动子上两个GATA-1位点对于A的功能是必要的

作为转录辅激活因子，乙酰转移酶A必须由特定的转录因子招募到靶基因的启动子上才

能行使其功能。在B基因启动子上有两个典型的转录因子GATA-1的结合位点(-124bp和-100bp)，GATA-1可能招募乙酰转移酶A到B基因启动子。为了验证这个假设我们将B基因启动子报告基因PGL3-E-BP、乙酰转移酶A (或A△HAT)以及GATA-1表达质粒共转染293T细胞。相对荧光素酶活性测定结果显示：报告基因PGL3-E-BP单独与乙酰转移酶A或GATA-1表达质粒共转染时，与对照相比，转录活性分别只增加了l倍和1.5倍，当与乙酰转移酶A和GATA-1表达质粒共转染时，启动子的转录活性增加了近20倍，远远超过了二者单独作用的加和，说明转录辅激活子乙酰转移酶A和转录因子GATA-1在B基因启动子的激活中具有强烈的协同作用。另外，A△HAT和GATA-1共转染时，对启动子的激活作用相当于二者单独作用的加和，所以GATA-1介导的乙酰转移酶A对B基因转录的作用有赖于乙酰转移酶A的HAT活性的，这些结果清晰地表明了乙酰转移酶A的HAT活性在B基因转录中的重要作用，同时又一次证明了组蛋白(或转录因子)的乙酰化修饰参与了B基因的转录调控。

上面的工作证实了GATA-1介导了乙酰转移酶A在B基因转录中的作用。在B基因启动

子上有两个GATA-1结合位点(-124bp和-100bp)，那么这两个位点中的哪一个参与了乙酰转移酶A的功能，还是两个都需要。为此我们构建了三个启动子位点突变体报告基因质粒: PGL3-E-BPM1(-124bp位点突变)、PGL3-E-BPM2 (-100bp位点突变)和PGL3-E-BPM3 (-124bp和-100bp两个位点都突变)。然后将它们分别与GATA-1和乙酰转移酶A共转染，相对荧光素酶活性分析结果显示，与野生型PGL3-E-BP相比，两个位点分别突变(PGL3-E-BPM1和PGL3-E-BPM2)时，乙酰转移酶A和GATA-1对启动子的协同激活作用明显降低，当两个位点都突变(PGL3-E-BPM3)时，乙酰转移酶A和GATA-1对B基因启动子的协同作用不复存在，由此可知两个GATA-1位点都参与了乙酰转移酶A的招募，而且两个位点的作用是互相促进的。

接下来我们想知道，GATA-1招募乙酰转移酶A激活B基因启动子转录是否与组蛋白乙酰化有关呢？通过报告基因染色质免疫沉淀(Reporter ChIP)实验，结果显示当乙酰转移酶A和

GATA-1表达载体与野生型报告基因（PGL3-E-BP）共转染细胞时，乙酰转移酶A在报告基因启动子上的结合有明显的增加，启动子组蛋白H4的乙酰化水平同时也有明显的升高，然而当把GATA-1位点突变体报告基因PGL3-E-BPM3 (两个GATA-1位点突变)、乙酰转移酶A和GATA-1表达载体共转染时，启动子组蛋白H4的乙酰化水平没有明显的变化，说明

GATA-1协同乙酰转移酶A确实能提高启动子处的组蛋白乙酰化水平从而促进B基因的转录。

3.6乙酰转移酶A与转录因子GATA-1和Sp1协同增强B基因启动子的转录活性

前面已证实Sp1参与B基因启动子的转录激活，但具体如何发挥作用需要进一步确证。为了探究Sp1是否参与对乙酰转移酶A的招募，我们将PGL3-E-BP与乙酰转移酶A和Sp1表达质粒共转染293T细胞，相对荧光素酶活性检测结果显示乙酰转移酶A和Sp1能协同激活PGL3-E-BP启动子的转录活性。当把GATA-1表达质粒加入到同一个共转染体系，启动子的转录活性提高了50倍。与前面结果相似，乙酰转移酶A△HAT与Sp1不再表现出协同作用，乙酰转移酶A△HAT、Sp1和GATA-1的共转染同样没有协同作用，再一次证明了乙酰转移酶A的乙酰转移酶活性在调控B基因表达中重要性。

根据以上实验,可以得出结论：转录辅因子乙酰转移酶A参与了B基因的转录调控，它通过与转录因子GATA-1及遍在转录因子Sp1相互作用强烈激活B基因启动子的转录活性。

4．应用案例：

1. Han L, Lu J, Pan L, Wang X, Shao Y, Han S, Huang B: Histone acetyltransferase p300 regulates the transcription of human erythroid-specific 5-aminolevulinate synthase gene. Biochemical and biophysical research communications 2006, 348(3):799-806.返回搜狐，查看更多