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通过对组织样本进行多重免疫组化（IHC）分析，研究人员可以原位探索不同靶标之间的空间关系，特别是对于肿瘤微环境的研究，因为它可以提供独特的信息，用来指导预后和治疗。目前，有越来越多的文献在肿瘤研究中使用多重 IHC，显示了其重要性。

多重分析可以提高发现新的生物标志物和治疗性靶向通路的速率。

相较于单靶标染色，多重成像对于肿瘤微环境的分析更加深入，因此能够给研究人员、临床医生和药物开发人员带来更多益处。从临床角度来看，相较于使用单个预测性生物标志物，同时检测多个生物标志物对于患者分级和对于治疗的反应预测更加可靠。对于基础研究，多重成像可以提高发现新的生物标志物和可治疗性靶向通路的速率。

在这些需求的驱动下，人们已经开发出了支持多重组织成像的各种方法。从顺序染色方案到先进的质谱技术，方法的灵敏度和同时检测靶标数量不断增加。虽然每种方法都有其自身的优点和注意事项，不过他们共性在于，数据的质量取决于使用抗体的质量。

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直标一抗

最经典的 IHC 染色，是使用一抗检测靶标，然后用酶或荧光标记的二抗来产生可见信号。基于酶显色的IHC 方案通常只检测一个靶标，而荧光 IHC（组织免疫荧光）通常会检测两到三个靶标（包括核染色）。在该实验方案中使用直标一抗可以缩短和简化实验。当蛋白表达丰度不低，或使用高亲和力的一抗，无需使用二抗来进行信号放大。

直标一抗的优势：

在染色方案中使用直标一抗可以缩短并简化实验。

顺序染色（比色法和荧光法）

连续染色循环可以实现多重组织成像。开展顺序免疫荧光检验的方法有很多，其中一些方法是在连续的几轮染色中将荧光标记的抗体添加到样本材料中。其中，MultiOmyx™ 超重免疫荧光检测在每次循环之间使用染料失活的化学方法在一张片子上同时研究多达 60 个生物标志物，而迭代间接免疫荧光成像（iterative indirect immunofluorescence imaging, 4i）则利用化学抗体洗脱同时染色 40 个靶标。

Opal™ 技术利用 HRP 标记的二抗来催化酪酰胺信号放大反应，通常用于增强对低丰度靶标的检测。一旦荧光标记的酪酰胺与目标蛋白上或周围的酪氨酸残基共价结合，就可以利用热修复来去除抗体，且不会干扰 Opal™ 荧光信号；随后，重复这一系列步骤。Opal™ 工作流程已经过优化，可使用 Leica Biosystems BOND RX，并且可与 Phenoptics™仪器搭配使用，提高通量。

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PD-L1 / PD1 Multiplex IHC-IF Antibody Panel (PD-L1, PD1, CD68, CD3, Ki67, panCK) (ab269812)

Merged staining of anti-PD1 (ab237728; orange; Opal™520), anti-PDL1 (ab237726; green; Opal™540), anti-CD68 (ab192847; yellow; Opal™570), anti-CD3 (ab16669; red; Opal™620), anti-Ki67 (ab16667; light blue; Opal™650) and anti-PanCK (ab7753; grey; Opal™690). The immunostaining was performed on a Leica Biosystems BOND® RX instrument with an Opal™ 7-color automation IHC kit (NEL821001KT, Akoya Biosciences®).

Roche Diagnostics 的 DISCOVERY ULTRA 也是一种自动化 IHC 平台，该平台同样需要反复添加未标记的抗体，然后利用热失活法在连续染色之间分离抗体。该系统广泛用于利用 DISCOVERY 色原体进行的多重 IHC，DISCOVERY 色原体是一个包含抗原靶标共定位的专用半透明试剂的产品系列；利用该系统进行多重 IHC 时，需要形成一种可以与另一色原体重叠的颜色。

寡核苷酸偶联抗体 - 抗体标记的新方法

​随着各种技术的发展，抗体-寡核苷酸偶联（antibody-oligonucleotide conjugates）在 IHC 中的使用越来越多，这种方法可以大大提高检测的灵敏度。Ultivue 的 InSituPlex® 技术和 Akoya Biosciences 的 CODEX® 技术均依靠寡核苷酸标记的抗体来进行组织成像。运行 Ultivue 方法期间，需将四种不同靶标的抗体同时添加到样本中，随后对偶联的寡核苷酸进行扩增；靶标检测需要添加了荧光标记的互补 DNA 探针。CODEX® 方法与 Ultivue 方法的相似之处在于，它也使用了染料标记；但是，它可以通过多轮染色进行超多重的成像分析，并且可以与 Opal™ 搭配使用，简化工作流程。

在 IHC 中使用抗体-寡核苷酸偶联（antibody-oligonucleotide conjugates）可以大大提高检测的灵敏度。

此外，还可以将半抗原标记（hapten-labeled）的抗体用于多重组织成像方案，这种方法也不需要使用不同种属来源的一抗来避免与二抗间的交叉反应。Cell Idx 的 UltraPlex 多重技术使用抗体-半抗原偶联对组织样本进行染色，并使用抗半抗原的二抗检测。通过连续切片，研究人员可以利用这种方法分析四种以上的生物标志物和一种核染色。

超多重染色方案

这些方法可以同时染色更多靶标，提供非常详细的组织“快照”，但是，也需要相应的非常专业的仪器。

NanoString 的数字空间分析 ( DSP) 工作系统使用 nCounter® 并搭配与光可降解的寡核苷酸标记的抗体可以同时检测多达 96 种蛋白。抗体结合后，使用紫外线释放标签，并对其定量，随后将标签定位回组织原位。该方法可以提供相应靶标的丰富的分析数据。

而Fluidigm 的质谱成像技术™ (IMC™) 和 IONpath 的多重离子束成像 (MIBI™) 技术均使用质谱仪在一个组织区域内获得多个标记。这两种技术都依赖金属标记的抗体，大大减少了荧光成像固有的溢出问题，并且允许在一项实验中使用更多抗体，以提高多重成像的程度，从而实现多达 40 个标志物的同时检测。

适合应用的优质抗体

无论选择哪种方法进行多重 IHC成像，都需要优质、可靠的抗体。研究人员在为多重 IHC 染色组合选择抗体时，是否进行了广泛且严格的验证，是否有批次间的高一致性至关重要。

Daniela Quail 博士是蒙特利尔麦吉尔大学古德曼癌症研究中心的助理教授。她的研究重点是肿瘤微环境（TME）在癌症进展过程中的作用。通过 Imaging Mass Cytometry™，Daniela 在一个组织上同时检测约 40 种不同的抗体来获取具有空间信息的高度多样化图像，以全面了解肿瘤内部和周围发生的事情。

“我们首次尝试这项技术时，我们需要特殊的抗体形式。Abcam 拥有不含载体蛋白形式的重组抗体，这种抗体是我们的理想选择，因为它们的批次间差异非常小。运行 IMC™ 时，我们要确保每次实验使用的抗体的质量完全相同，否则，我们必须一次又一次地优化和验证抗体批次。

对于在 IMC™ 等技术上投入大量资金的科学家而言，使用重组抗体真的大有裨益。如果抗体用完了，我们不想回到零点，一切从头开始，那样只会浪费时间。迄今为止，我们已经测试了数百种抗体，Abcam 的不含载体蛋白形式的重组抗体对我们来说是最可靠的。这些抗体在金属偶联后仍然有很高的回收率。”

对于多重染色，在选择抗体时应：

-  选择经IHC应用测试的抗体。

RabMAb® 重组兔单抗提供了更高的灵敏度，同时不会损失特异性，成为了免疫组化 (IHC) 特别是多重/超多重染色的理想选择。它与各种组织固定工艺兼容，有着更高的稀释度，且免疫组化QC始终在TMA组织芯片（人源多器官FFPE 组织）上进行。

经过 IHC 验证的 RabMAb® 重组兔单抗超过4000多重，所有抗体都可以提供无载体蛋白形式（BSA and Azide free）。查看更多。