两大方法帮你搞定质粒构建 |
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(2)反向引物:5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端 如果目的基因片段较长的话,可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段 [可选 PCR 扩增体系] ddH2O:14ul 10xTaq buffer:2ul 10um DNTP:1ul 10um primer F:0.5ul 10um primer R:0.5ul 模板 DNA:1ul Taq 酶:1ul [可选 PCR 扩增条件] (1)95℃:5min (2) 35cycle 95℃:30s 55℃:30s(退火温度可以根据目的引物TM值决定,一般退火温度根 据引物TM值降低5度) 72℃:40s (3)72℃:10min (4)16℃:hold 引物扩增之后,首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小,然后通过胶回收,获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基,回收产物需要进行双酶切,双酶切方法与质粒酶切方法相同。 3. 载体与目的基因的连接,推荐在 10~20μl 反应体系中进行接反应。 [可选连接体系] 载体 25 ng 退火产物 2 ul 10 x T4 buffer1 ul T4 DNA ligase 1 ul T4 连接酶一般选择 4 度过夜 4. 转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。 5. 挑取单克隆,并鉴定 挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。 贰 下面开始重点介绍重组酶构建质粒,基于同源基因重组原理,适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆,无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp~10 kb 片段,同时构建时间也大大缩短。 1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化,线性化完全,假阳性克隆低。酶切体系同上。 2. 对于使用重组方式连接来说,PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列,通过 PCR扩增方式进行连接,PCR 的产物要纯化。 引物设计原则简单总结一下: (1)前向引物:5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端 (2)反向引物:3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端 如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长,可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。 [可选PCR 扩增体系] ddH2O 14 ul 10 x Taq buffer 2 ul 10 um DNTP 1 ul 10 um primer F0.5 ul 10 um primer R 0.5 ul Vector 1 ul Taq 酶 1 ul [可选PCR 扩增条件] (1)95℃:5min (2) 35cycle 95℃:30s 55℃:30s(退火温度可以根据目的引物TM值决定,一般退火温度根 据引物TM值降低5度) 72℃:40s (3)72℃:10min (4)16℃:hold PCR 扩增后,通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切,直接用于重组反应。 3. 目的引物与线性载体进行重组反应。 [可选重组体系] 5 × CE II Buffer 4 μl 线性化克隆载体 50~200 ng 插入片段扩增产物20~200 ng Exnase®II 2 μl ddH2O x ul 在冰水浴中配制,配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高,反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率,这样大大减少了连接时间。 4. 转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。 5. 挑取单克隆,并鉴定 挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。 最后,几个主要注意事项: 1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列,且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%~60% 范围之内时, 克隆效率将达到最大. 2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2,即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得: 最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng(0.03 pmol) 最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng(0.06 pmol) 3. 双酶切 1 和 2,在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题,可在 NEB 公司主页的 Double Digest Finder 里面进行查询。 想要做好质粒构建,试剂盒的选取十分重要,Omega 的质粒提取试剂盒比较优质,国内有很多代理商可以提供,扫描下方二维码,可以索取相关技术资料以及产品信息。返回搜狐,查看更多 |
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