今天来学习一篇综述，了解用于 RNA 递送的脂质纳米颗粒的化学性质。

Title:Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery. 发表时间：2022年1月

内容摘要

脂质纳米颗粒 (LNP) 是一种具有均质脂质核心的脂质囊泡。这些囊泡广泛用于小分子药物和核酸递送，最近因其作为 COVID-19 mRNA 疫苗递送平台的显著成功而备受关注。尽管如此，由 mRNA 诱导的瞬时蛋白质表达的用途远远超出了针对传染病的疫苗——它们还有望作为癌症疫苗、蛋白质替代疗法和罕见遗传疾病的基因编辑组件。然而，裸mRNA本质上是不稳定的，容易被核酸酶和自水解快速降解。mRNA在LNP中的包封可保护mRNA免受细胞外核糖核酸酶的侵害，并有助于细胞内mRNA递送。这篇综述讨论了用于RNA递送的LNP的核心特征。从以下几个方面展开介绍：

首先介绍了 LNPs 的概念，利用核酸作为治疗剂的优缺点。简单叙述了基于 LNP 的核酸疗法的最新临床成功。

其次描述了LNP自组装的理论和方法。所有制备方法背后的共同规律是诱导核酸和带电脂质之间的静电相互作用，并通过疏水相互作用促进纳米颗粒的生长。

第三分解 LNP 的组成，特别注意每个组件的基本特性和用途，包括确定的分子设计标准、采购来源、对细胞内运输的影响以及对 LNP 特性的影响。LNPs 的关键成分之一是可电离的脂质，它启动与内体膜的静电结合并促进细胞溶质释放；然而，不应忽视其他脂质成分的作用，因为它们与 LNP 的稳定性、清除和分布有关。

第四回顾了 LNP 构建体的整体属性--LNP 大小、电荷、内部结构、脂质堆积、脂质膜水合、稳定性和对生物大分子的亲和力，这些属性可以严重影响 RNA 传递。讨论了用于检查这些属性的特定技术以及如何调整。

背景

裸RNA是一种带负电荷的亲水性大分子，细胞膜的静电排斥，难以进入细胞；会被无处不在的RNases迅速降解。它需要一个保护壳才能进入细胞内部。

由于细胞膜主要由脂质组成，有利于脂质囊泡包裹 RNA 通过细胞膜并将 RNA 释放到细胞质。

囊泡需要一种带正电的脂质，该脂质会锁定带负电的 RNA。然而，由永久阳离子脂质组成的囊泡会由于带负电荷的细胞膜的静电破坏而引起细胞毒性。

脂质结构进一步进化以获得响应酸性内溶酶体途径的正电荷。LNP 的组成也已扩展到包括结构脂质（以模拟细胞膜并屏蔽正电荷）和聚（乙二醇）锚定脂质（以防止 LNP 聚集和与生物环境发生不希望的相互作用）。

主要里程碑事件，FDA 批准了第一个 siRNA-LNP 药物 (Onpattro) 和 mRNA-LNP COVID-19疫苗 (Comirnaty) 和 Moderna 的 COVID-19疫苗的紧急使用授权 (EUA) ─基于 LNP 的核酸递送方法安全且适用于各种治疗药物。

主要内容

1、LNP的基本特性

最佳 LNP 尺寸为 20-200 nm，因为该尺寸使其足够坚固以承受流体流动（例如，血液和淋巴液），同时允许 LNP 穿过间质。LNP 大小通常通过改变 PEG-脂质的数量或混合参数（例如，流速和体积比）来调节。45 nm siRNA LNPs 对皮下给药最有效，而 80 nm siRNA LNPs 对小鼠静脉给药最有效。

LNP 表面电荷负责与细胞膜和生物环境的相互作用。由于细胞膜带负电荷，具有负表面电荷的 LNP 被膜排斥，不会被细胞吸收。另一方面，带正电荷的 LNP 可能直接破坏细胞膜并引起细胞毒性。这就是可电离脂质在 LNP 设计中至关重要的原因。最初，含有可电离脂质的 LNP 是中性的，可避免任何不需要的静电相互作用，但在酸性内体 pH 值下获得正电荷。LNP 的表面电荷通常通过 zeta 电位测量来评估。这种技术通常用于评估胶体聚集，虽然没有严格的分类，如果 zeta 电位介于 -20 和 +20 mV 之间，则认为表面电荷很弱。调整 LNP 总表面电荷的常用方法是调整 N/P 比或可电离脂质（N，对于阳离子胺）与核酸（P，对于阴离子磷酸盐）的比率。

2、LNP的制备、组成

LNP 的制备依赖于自组装，即基于分子间相互作用将脂质成分自发组织成纳米结构实体。这种自发组织通常受非共价分子间相互作用的控制，例如静电、疏水、范德华和 π 效应。

LNP 的形成始于带负电荷的核酸和带正电荷的脂质之间的静电结合。然后，LNPs 通过脂质成分之间的疏水和范德华相互作用生长。由于脂质化学的多样性、核酸的独特性质以及两者混合发生的时间尺度，自组装早期阶段的表征和对最终 LNP 特性的相关影响仍然存在困难。此外，LNP 制备方案至少以两种方式影响自组装产物：LNP 的同质性和核酸装载效率。

Structure  of  LNP–siRNA  as  compared  to  liposomes. LNP-siRNA结构与脂质体比较。

A,B) LNP-siRNA配方中含有可电离氨基脂的拟议结构A)围绕siRNA的倒置胶束结构(红色)，以及B)相应的低温透射电镜图像。在LNP-siRNA中观察到的电子密集的核心结构很可能是颗粒内脂质和核酸的电子衍射的结果。

C,D)相反，脂质体配方(如图(C)所示)含有一个水核，其电子密度与脂质体的外部一致。

对于含有高阳离子脂质含量的 LNP-siRNA 系统，由于静电相互作用，阳离子脂质优先与 siRNA 结合，连同胆固醇和可能的一小部分 DSPC，它们在 siRNA 周围形成反向胶束。此外，过量的阳离子脂质、胆固醇和可能的一小部分 DSPC 会形成“空”反胶束。这些聚集的反胶束被一层 PEG 脂质、DSPC 和胆固醇包被。 

用较低的阳离子脂质含量和较高比例的DSPC 制备的 LNP-siRNA 系统导致形成一些主要由阳离子脂质和胆固醇组成的倒置胶束；DSPC 更多在双层区域。

对于含有较长核酸的 LNP，如 mRNA 或质粒 DNA，阳离子脂质主要与 mRNA 或 DNA 结合形成固体核心结构，而形成双层的 DSPC 主要分离成双层“泡”结构。

3、不同 LNP-siRNA 制备方法的比较

脂膜水化+挤出、预制囊泡法、错流注射、交错人字形微混合器SHM、微流体流体动力聚焦MHF

4、配方组成--阳离子（Cationic lipids，CLs）和可电离脂质（ionizable lipids,ILs）

Schematic representation of CLs（Cationic lipids） and ILs（ionizable lipids） and their components (headgroup, linker, and tails).

阳离子脂质 (CLs) 和可电离脂质 (ILs) 通过静电相互作用启动自组装的第一步。含有 CL 的脂质复合物仍广泛用于递送核酸。然而，由于毒性问题和缺乏体内功效，它们已被 pH 敏感 ILs 取代。当配制成 LNP 时，这些脂质被设计为在生理 pH 值下显示净中性，但在酸性内体内部带正电荷。由于改进的功效和毒性特征，pH 依赖性电离性使其成为核酸递送的合适材料。这些脂质通常占配方中总脂质的 30-50%。许多研究致力于微调 ILs 的特性以进一步提高效率，特别是在难以触及的组织中。CL 和 IL 的整体架构可以分为三个部分：(1) 头部组，(2) linker，和 (3) 尾部。

linker通常将头部与尾部连接起来，尽管liner也可能埋在尾部内（SM-102 和 ALC-0315）。linker影响 LNPs 的稳定性、生物降解性、细胞毒性和转染效率。CL 和 IL 设计中使用的常见linker如上图。ILs 可能包含一个或几个linker。linker可分为不可生物降解的（例如，醚和氨基甲酸酯）和可生物降解的（例如，酯、酰胺和硫醇）。

优选可生物降解的接头，因为它们通常在体内显示出快速清除，能够多次给药并降低副作用的倾向。值得注意的是，DLin-MC3-DMA、ALC-0315 和 SM-102 都具有酯接头。对于 SM-102，酯基周围的修饰显示会影响 LNP 的清除率、制剂稳定性和转染效率。

5、Structures and cpKa and cLogP values for selected ILs.

IL 的头部基团通常带有正电荷。头基的尺寸和电荷密度负责捕获核酸、稳定 LNP、与细胞膜相互作用并促进内体逃逸。IL 可能包含几个可电离的头基，尽管具有一个头基的 IL 更常见。典型的头基包括胺（从伯胺到季胺）、胍和杂环基团。IL（DLin-MC3-DMA，SM-102和 ALC-0315）含有一个叔胺头基，它显示出依赖于 pH 的电离作用。ALC-0315 和 SM-102 的头基还含有一个末端羟基，可以减少头基的水合并改善与核酸的氢键相互作用，从而可能提高转染能力。

6、LNP配方中使用的甾醇(绿色)、磷脂(蓝色)和聚乙二醇脂类(红色)。

Examples of sterols (green), phospholipids (blue), and PEG-lipids (red) used in LNP formulations.

sterols，固醇

胆固醇是一种天然丰富的细胞膜成分，是一种常用于 LNP 制剂的所谓结构脂质。胆固醇通常占 LNP 制剂中总脂质的 20-50%。作为动物细胞膜的丰富成分，胆固醇通常从羊毛等自然资源中大量提取。尽管其天然丰富，但直到最近，胆固醇在细胞摄取中的作用一直被忽视。有趣的是，用天然存在的植物甾醇（如 β-谷甾醇）代替胆固醇和氧化的胆固醇衍生物在 mRNA 递送方面产生了显着改善，这可能是由内吞途径中的不同脂质运输决定的和增强的 LNP 的内体逃逸。

磷脂

磷脂有助于包装核酸并稳定 LNP。与其他脂质成分相比，它们的研究相对较少，通常仅占配方中总脂质的 10-20%。磷脂被用作结构脂质，因为它们自发组织成脂质双层和高相变温度，这赋予了 LNP 的膜稳定性。与细胞膜一样，磷脂位于 LNP 的外围。这些脂质通常是半合成的。例如，磷脂酰胆碱通常来源于天然来源，例如蛋黄和大豆，并且可以进行化学修饰以包括脂肪酸尾巴。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC)是一种结构脂质，用于临床批准的 LNP，例如 siRNA 治疗剂 (Onpattro) 和针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗. DSPC 在结构上由一个磷脂酰胆碱头基和两个饱和的 18 碳尾组成，形成一个紧密堆叠的脂质双层。在 LNP 中，它主要位于纳米颗粒表面，次要位于纳米颗粒核心。1,2-Dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) 是另一种经常用于 LNP 临床前研究的磷脂。DOPE 的不饱和尾部可形成更流动的脂质层。

聚乙二醇

控制其半衰期和细胞摄取的 LNP 的一个重要模块是 PEG 锚定脂质（PEG-脂质）。

在 LNP 组装过程中，由于其亲水性和体积庞大，PEG 链位于纳米颗粒的外壳中。与其他纳米载体一样，PEG 为 LNPs 提供了一个外部聚合物层，以阻碍血清蛋白和单核吞噬细胞系统的吸附，延长体内循环时间。PEG 还可以防止纳米颗粒在储存和血液中的聚集。

此外，PEG-脂质的量可以决定粒度。 

PEG-脂质的另一个潜在目的是使 LNP 的表面功能化。功能化的 PEG 脂质能够使 LNP 与配体或生物大分子进行生物共轭。例如，辛格等使用 DSPE-PEG-amine 通过 NHS/EDC 化学结合透明质酸用于肿瘤靶向，和 Parhiz 等使用 DSPE-PEG-马来酰亚胺通过 SATA-马来酰亚胺化学结合抗体。

虽然 PEG 对 LNP 稳定性和生物共轭很有用，但它的解吸对于细胞转染也很关键。从 LNP 中脱落的 PEG 允许血清蛋白（例如载脂蛋白和白蛋白）调理作用，它们是受体介导的 LNP 内吞作用的关键效应物。已证明 ApoE 与 LNP 结合，导致低密度脂蛋白受体 (LDLR) 介导的肝细胞内化。由于 PEG-脂质抑制 ApoE 与 LNP 的结合，因此过量的 PEG-脂质会对 LNP 的细胞摄取和转染产生不利影响。由于容易与 ApoE 结合，含有较少 PEG 脂质的 LNP 在递送核酸方面似乎更有效。PEG-脂质的脂质锚的长度也是决定解吸速率的重要因素。

7、LNP在其生命周期中遇到的pH值波动。

pH flfluctuations that an LNP encounters in its life cycle. Figure created with BioRender.

膜水合也可能影响对 pH 值的潜在反应，这是一种关键的环境触发因素，通常用于启动核酸释放。当 LNP 进入细胞内空间时，它们被困在内体中，随着它们成熟为溶酶体，内体逐渐酸化。因此，脂质膜内较高的水含量可能会影响酸化动力学并有助于膜的快速不稳定。

8、LNP结构中仍未回答的问题。

Unanswered questions remaining in the LNP structure. Figure created with BioRender

LNP 是一种高度可定制的核酸递送载体，在 mRNA 疫苗中显示出巨大的潜力。然而，LNP 的科学才刚刚开始，还有许多悬而未决的问题。

脂膜性质如何影响转染效率?

脂质成分分布在哪里?

脂质在长期储存时会分离吗?

核酸如何与可电离脂类结合?

精细的内部结构是否阻止了tRNA的降解?

是什么影响每个纳米粒子的RNA链数?

小结

LNPs是一种高度可定制的核酸传递载体，在mRNA疫苗中显示出巨大潜力。人们也不应忘记它们在罕见疾病和癌症治疗方面的潜在价值。mRNA疗法可以帮助产生治疗性蛋白质，以恢复受损组织或器官的功能。在全球范围内进行了大量的科学研究，以设计和改进LNPs的单个组件，以有效和安全地递送感兴趣的核酸。然而，LNPs的科学研究似乎才刚刚开始，仍有许多未解之谜。

毫无疑问，公众对mRNA疫苗的兴趣激增将加快这一领域的研究工作，我们谨慎乐观地认为，我们正在见证纳米医学的新时代。

参考文献： Eygeris Y, Gupta M, Kim J, Sahay G. Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery. Acc Chem Res. 2022;55(1):2-12. doi:10.1021/acs.accounts.1c00544. 来源于：Of Stuties/医药速览 2023-02-11