如何解决层析中的保留时间问题 |
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如何解决层析中的保留时间问题
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蛋白洗脱时间是否不正确？蛋白洗脱是否发生得太早、太晚或根本没有发生？如果保留时间超出预期，请继续阅读以了解如何快速确定可能的原因及解决方案。 使用 IEX 时，蛋白洗脱时间比预期早，原因很简单，例如缓冲液条件不正确。 使用 SEC 时，如果蛋白洗脱时间比预期晚，可能原因为蛋白与基质之间发生离子相互作用。 Cytiva R&D 蛋白纯化专家总结了保留时间超出预期的其他常见原因及解决方案，见下表。 蛋白洗脱时间比预期早–可能原因和补救措施： 可能原因补救措施 IEX*、HIC*：层析柱未充分平衡 重复或延长平衡步骤直到电导率和 pH 值恒定IEX：样本或缓冲液的离子强度过高或 pH 值不正确 降低样本或缓冲液的离子强度 提高 pH 值（阴离子交换剂） 降低 pH 值（阳离子交换剂）HIC：样本和缓冲液的盐浓度太低 增加样本和缓冲液中的盐分 蛋白洗脱时间比预期晚或根本没有洗脱–可能原因和补救措施： 可能原因补救措施 蛋白或脂质沉淀在层析柱或层析柱过滤器上 清洁层析柱并更换或清洁过滤器洗脱缓冲液中的蛋白不稳定或无活性 确定蛋白的 pH 值和盐稳定性交付的梯度失真 泵中出现气泡：根据用户手册净化泵 泵止回阀故障：以高流速冲洗止回阀和/或在超声浴中清洁 泵密封圈磨损：更换密封圈SEC： 蛋白与基质之间发生离子相互作用 将缓冲液的离子强度保持在 50 mM 以上（最好包括最多 300 mM 的氯化钠）蛋白和基质之间发生疏水相互作用 降低盐浓度以最小化疏水相互作用。增加 pH 值。添加合适的去污剂或有机溶剂（例如，5% 异丙醇）IEX： 缓冲液 pH 值不正确 检查 pH 计校准情况。使用更接近蛋白 pI 的缓冲液 pH 值离子强度太低 增加洗脱缓冲液中的盐浓度蛋白和基质之间发生疏水相互作用 降低盐浓度以最小化疏水相互作用。增加 pH 值。添加合适的去污剂或有机溶剂（例如，5% 异丙醇）HIC： 盐浓度太高 降低洗脱缓冲液中的盐浓度疏水相互作用太强 使用疏水性较低或配基密度较低的填料 考虑使用添加剂以减少疏水相互作用 蛋白在外水体积之前洗脱（凝胶过滤层析）–可能原因和补救措施： 可能原因补救措施 层析柱中存在窜流 使用较稀的填料浆液重新填充层析柱。避免引入气泡在此处查看更多层析故障排除技巧 *SEC = 凝胶过滤层析 IEX = 离子交换层析 HIC = 疏水层析 |
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