对于做分子生物学实验的小伙伴来说，Nanodrop是不可或缺的存在。作为一款微量分光光度计（Microvolume spectrophotometers，MVS），Nanodrop能够在包括紫外及可见光区域在内的光谱范围内检测样品的吸光度信号，并且仅需测定少量体积（0.5-2 μl）即可提供核酸（Nucleic Acid，NA）浓度与纯度的分析结果，用于下游的逆转录、qPCR等实验研究。以Nanodrop One为例，仪器生成数据如下图所示：

在结果中出现的几个重要数值，那么：

（1）核酸浓度是怎样计算的？

（2）A260、A280与A230值分别代表什么？

（3）A260/A280与A260/A230比值的标准范围是多少？比值异常可能是由哪些原因造成的？

（4）仅用两个比值评估核酸纯度准确吗？

这一篇和小编一起来学习吧~

核酸浓度的计算

在之前文章中小编曾提到一切定量计算的原理都来自于朗伯比尔定律（Beer-Lambert Law）：

A=εcp

c= (1/εp)×A

其中：

c：浓度（concentration）；A：吸光度（Absorbance）；ε：消光系数（extinction coefficient）；

p：光程（path length）。

根据公式可知核酸浓度c与吸光度A之间成正比，(1/εp)即为系数（factor，f），可得：

c= f×A

其中：

c：浓度（ng/μl）；A：吸光度；f：系数（ng·cm/μl）。Nanodrop使用的系数（f）为：

双链DNA（dsDNA）f=50 ng·cm/μl

单链DNA（ssDNA）f=33 ng·cm/μl

RNA f= 40 ng·cm/μl

但是这个浓度计算只适用于实验过程中DNA/RNA的定量，对于Oligo的定量这样计算并不准确。尤其对于较短的序列、重复序列以及带有特殊修饰基团的Oligo序列，每个碱基的组成、排列顺序和修饰都会影响消光系数数值，这个计算会引起很大的偏差。Oligo精准定量的详细计算过程戳这里

A260、A280与A230

A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，由于核酸结构中的芳香碱基部分，包括嘧啶碱基（T、C、U）与嘌呤碱基（A、G）的最高吸收峰均在260 nm，因此A260值用于核酸定量计算（dsDNA、ssDNA与RNA），上述公式c= f×A中A即为A260值。

A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，蛋白质中色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸与胍氨酸的芳香氨基酸链与有机化合物中的芳香性苯酚的最高吸收峰均接近280 nm。

A230是盐类、多糖、有机溶剂等最高吸收峰的吸收波长，包括硫氰酸胍（GTC）、盐酸胍（GuHcl）、EDTA、TritonTMX-100、Tween® 20、Trizol、Ethanol、碳水化合物（多糖）等最高吸收峰均接近230 nm。如下图所示，图1为典型的核酸光谱图，图2为包含常见两种污染物（盐酸胍、苯酚）的核酸光谱图，a. pure DNA、 b.胍盐污染、c.苯酚污染[3]。